用于检测微小残留病的方法、试剂以及试剂盒技术

本发明专利技术涉及微小残留病(MRD)诊断领域，其越来越多地应用于评价患有血液恶性肿瘤患者的治疗效力，例如B细胞前体急性淋巴细胞白血病(BCP-ALL)、B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)和多发性骨髓瘤(MM)。所提供的独特试剂组合物具有经仔细选择和彻底测试的抗体组合，对于≥8色流式细胞术染色以及对于10色和12色流式细胞术染色，其可达到至少10-4甚至低至10-5的灵敏度。本发明专利技术还提供了诊断试剂盒和用于检测MRD的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及癌症诊断领域，更特别地涉及用于在治疗期间和治疗后监测疾病发展或者用于检测微小播散性疾病的手段和方法。抑制细胞治疗或细胞毒剂治疗诱导大多数患有淋巴样恶性肿瘤患者中的缓解。然而，这些患者中的许多都会复发。显然，虽然根据细胞形态学标准它们达到了所谓的完全缓解，但是现有的抑制细胞治疗或细胞毒剂治疗方案不能杀伤这些复发患者中的所有恶性细胞。因为细胞形态学技术的检出限不低于1％至5％恶性细胞，所以显然该技术仅可提供关于治疗效力的表面信息，仍有多达1010的肿瘤细胞潜在地留在体内。需要灵敏度更高的技术来检测“微小残留病(minimal residual disease)”或微小疾病(MRD)以获得对诱导治疗期间肿瘤块的减少以及维持治疗期间从一种或多于一种组织中进一步根除恶性细胞的更好理解。应用流式细胞术检测MRD通常基于经由与恶性肿瘤相关的表型特征来区别恶性细胞与正常白细胞，例如抗原的异常表达、过表达和跨系表达。现有的4色和6色流式细胞术在多数患有血液恶性肿瘤(hematological malignancy)的患者中达到了10-3(至10-4)的良好灵敏度。然而，应注意在治疗期间和治疗后以及在造血干细胞移植后，高频正常再生细胞可妨碍血液、骨髓和其他体液(例如脑脊髓液)中低频恶性细胞的检测。每种治疗方案、每个治疗阶段、每段取样时间的再生的程度和模式存在差异，并且似乎取决于先前治疗的强度：治疗的强度越大，造血细胞的再生越显著。逻辑上，再生细胞的背景和药物诱导的免疫表型偏移两者均降低了现有4色和6色流式细胞术MRD方法的灵敏性和特异性。这主要导致了以下方法：其中使用多种标志物的组合来评价患者的MRD或者另外使用一种或数种患者特异性的标志物组合。认识到需要改进MRD的诊断方法，本专利技术人着手于鉴定可用来获得用于检测MRD的更灵敏和更可靠测定的另外的标志物，特别地基于其中经由多变量分析来组合多个标志物信息的完全整合方法。此外，该新方法不再限于个别患者，而是适用于特定疾病类别的每个患者，例如B细胞前体急性淋巴细胞白血病(B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia，BCP-ALL)、B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-cell chronic lymphocytic leukemia，B-CLL)和多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)。在仔细地选择相关标志物后，设计多色管中抗体的适当组合并且选择合适的荧光染料(基于对亮度、补偿、稳定性等的需要)来开发抗体试剂集(set)。为了重塑(reshape)并实现最佳功效，采用共有组(consensus panel)的广泛多中心评价(extensive multicentric evaluation)对研究进行补充。本专利技术人仔细地选择并且彻底地测试抗体组合，设计了可达到10-4至10-5灵敏度的新的≥8色染色。基于设计-测试-再设计-再测试-再设计(等)，已经开发了针对每种疾病类别(例如BCP-ALL、B-CLL和MM)之荧光染料缀合抗体的特异性组合。每位患者的一种或两种≥8色组合将允许以至少10-4的灵敏度仔细地进行MRD监测。所提供的10色和12色抗体组合甚至可更好地区别正常细胞和其恶性对应物，由此使得MRD检测的灵敏度能够低至10-5。我们在此提供了新的8色、10色和12色抗体组合，其用于检测从患有以下疾病的患者所分离样品(例如，血液或骨髓)中的MRD：-B细胞前体急性淋巴细胞白血病(BCP-ALL)-B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)或者-多发性骨髓瘤(MM)和相关的浆细胞病(plasma cell disorder，PCD)。这些多色免疫染色可根据如Van Dongen等Leukemia 2012；26：1908-1075和由Kalina等Leukemia 2012；26：1986-2010所述的所谓的EuroFlow方案进行。因此，本专利技术提供了用于对MRD进行流式细胞术检测的独特试剂组合物，其包含至少八种不同的荧光染料缀合抗体的组合。特别地，所述试剂组合物用于检测患有BCP-ALL、B-CLL或MM/PCD患者的MRD。在一个优选实施方案中，所述组合物包含针对给定CD抗原的单克隆抗体。CD代表簇命名并且是用于鉴定由单克隆抗体限定的特定细胞表面抗原或细胞内抗原的术语。针对所指定标志物的(单克隆)抗体可购自许多公司，包括Becton/Dickinson(BD)Biosciences、Dako、Beckman Coulter，CYTOGNOS、Caltag、Pharmingen、Exbio、Sanq uin、Invitrogen等。流式细胞术MRD检测BCP-ALL在一个实施方案中，本专利技术提供了用于对人对象中的BCP-ALL细胞进行流式细胞术检测的试剂组合物，其包含至少八种不同的荧光染料缀合抗体的组。BCP-ALL组包含针对四种“核心标志物”CD10、CD19、CD20、CD34和CD45的抗体。优选地，所述组还包含选自针对CD38、CD81、CyIgμ和脱氧核苷酸转移酶(NuTdT)之抗体的一种或更多种抗体。如果所述组还包含一个或更多个选自以下的抗体集，则会获得非常好的结果：(a)针对CD66c和CD123的抗体集；(b)针对CD304和CD73的抗体集；以及(c)针对SmIgκ和SmIgλ的抗体集，其中使每一个集内的抗体与相同的荧光染料缀合。在一个特定方面中，所述BCP-ALL组包含针对CD10、CD19、CD20、CD34、CD45的抗体，选自针对CD38、CD81、CyIgμ、NuTdT之抗体的一种或更多种抗体以及选自以下的两个或更多个抗体集：(a)针对CD66c和CD123的抗体集；(b)针对CD304和CD73的抗体集；以及(c)针对SmIgκ和SmIgλ的抗体集，其中使每一个集内的抗体与相同的荧光染料缀合。例如，试剂组合物包含针对以下标志物组合之一的不同的荧光染料缀合抗体：(i)CD20、CD45、CD81、CD66c、CD123、CD34、CD19、CD10和CD38，其中使针对CD66c和CD123的抗体与相同的荧光染料缀合；(ii)CD20、CD45、CD81、CD304、CD73、CD34、CD19、CD10和CD38，其中使针对CD304和CD73的抗体与相同的荧光染料缀合；(iii)CD20、CD45、NuTdT、SmIgκ、SmIgλ、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于对人对象中的B细胞前体ALL(BCP‑ALL)进行流式细胞术检测的试剂组合物，其包含至少八种不同的荧光染料缀合抗体的组，所述组至少包含针对核心标志物CD10、CD19、CD20、CD34和CD45的抗体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.06.14 US 61/659,5241.一种用于对人对象中的B细胞前体ALL(BCP-ALL)进行流式细
胞术检测的试剂组合物，其包含至少八种不同的荧光染料缀合抗体的组，
所述组至少包含针对核心标志物CD10、CD19、CD20、CD34和CD45
的抗体。
2.根据权利要求1所述的试剂组合物，其中所述组还包含选自针对
CD38、CD81、CyIgμ和脱氧核苷酸转移酶(NuTdT)之抗体的一种或更
多种抗体。
3.根据权利要求1或2所述的试剂组合物，其中所述组还包含一个
或更多个选自以下的抗体集：
(a)针对CD66c和CD123的抗体集；
(b)针对CD304和CD73的抗体集；以及
(c)针对SmIgκ和SmIgλ的抗体集。
4.根据权利要求3所述的试剂组合物，其中使每一个集内的抗体与
相同的荧光染料缀合。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的试剂组合物，其包含针对以
下标志物组合之一的不同的荧光染料缀合抗体：
(i)CD20、CD45、CD81、CD66c、CD123、CD34、CD19、CD10
和CD38，其中使针对CD66c和CD123的抗体与相同的荧光染料缀合；
(ii)CD20、CD45、CD81、CD304、CD73、CD34、CD19、CD10
和CD38，其中使针对CD304和CD73的抗体与相同的荧光染料缀合；
(iii)CD20、CD45、NuTdT、SmIgκ、SmIgλ、CyIgμ、CD19、CD34
和CD10，其中使针对SmIgκ和SmIgλ的抗体与相同的荧光染料缀合。
6.根据权利要求5所述的试剂组合物，其包含针对标志物CD20、
CD45、CD81、NuTdT、CD66c、CD123、CD304、CD73、CD34、CD19、
CD10和CD38的不同的荧光染料缀合抗体，以及选自以下的一个或更多
个抗体集：
(a)针对CD66c和CD123的抗体集；
(b)针对CD304和CD73的抗体集；以及
(c)针对SmIgκ和SmIgλ的抗体集，其中使每一个集内的抗体与相
同的荧光染料缀合。
7.根据权利要求6所述的试剂组合物，其包含针对标志物CD20、
CD45、CD81、NuTdT、CD66c、CD123、CD304、CD73、SmIgκ、SmIgλ、
CyIgμ、CD34、CD19、CD10和CD38的不同的荧光染料缀合抗体，其
中使针对CD66c/CD123、CD304/CD73和SmIgκ/SmIgλ中每一个集的抗
体与相同的荧光染料缀合。
8.一种用于对人对象中的慢性淋巴细胞白血病(CLL)进行流式细
胞术检测的试剂组合物，其包含至少八种不同的荧光染料缀...

【专利技术属性】
技术研发人员：雅各布斯·约翰内斯·玛丽亚·万东恩，何塞·阿尔贝托·奥尔方德马托斯克瑞亚埃韦尔，朱安·亚历杭德罗·弗洛雷斯蒙特罗，茱莉亚·玛丽亚·阿尔梅达帕拉，文森特·亨利库斯·约翰内斯·万德费尔登，塞巴斯蒂安·博埃特赫尔，朗托尼·威廉·朗格拉克，埃斯特尔·迈斯特日科娃，托马斯·什切潘斯基，马蒂亚斯·里特根，保罗·约根·蒙泰罗达席尔瓦卢西奥，
申请(专利权)人：鹿特丹伊拉斯姆斯大学医疗中心，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL