一种基于高通量测序构建白血病微小残留病灶TCR文库的多重PCR引物和方法技术

本发明专利技术提供了一种基于高通量测序构建白血病微小残留病灶TCR文库的多重PCR引物，包括上游引物和下游引物，所述上游引物为比SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:25所示的核苷酸序列多或少0～3个碱基的核苷酸序列组成的上游引物组；所述下游引物为比SEQ ID NO:26～SEQ ID NO:38所示的核苷酸序列多或少0～3个碱基的核苷酸序列组成的。本发明专利技术提供的多重PCR引物组能高效构建白血病患者的T淋巴细胞受体高通量测序文库，可获得丰富的白血病微小残留病灶TCR重排信息。

【技术实现步骤摘要】
一种基于高通量测序构建白血病微小残留病灶TCR文库的多重PCR引物和方法
本专利技术属于分子生物学领域，特别是涉及一种基于高通量测序构建白血病微小残留病灶TCR文库的多重PCR引物和方法。
技术介绍
白血病(leukemia)是以骨髓和/或外周血中幼稚细胞增多为特征的血液系统恶性克隆性疾病。在初诊时，病人体内白血病细胞总数约为1012，经化疗取得形态学的完全缓解(CompleteRemission，CR)后，残留的白血病细胞总数低于109，这种形态学方法难以检测、且体内仍残存着少量白血病细胞的状态称为白血病微小残留病(minimalresidualdisease，MRD)。体内残留的MRD使急性T淋巴白血病患者有>50％复发率。因此要定期检测MRD，对设计个体化的治疗方案显得更为重要。T细胞基因座上大量V、J基因片段在受体的合成中会产生各种多样重排，在V-J，V-D和D-J接合体之间的核苷酸不依赖模板插入或删除，与高频变异类似，这进一步增加了受体潜在的多样性。受体的这种潜在多样性很难随机产生相同的CDR3序列，从而使每个CDR3序列有效地成为一个T细胞克隆的唯一标签。因此对于T淋巴细胞IGH基因CDR3区域的序列组成进行测序可以很好的反映TCR免疫组库的组成及应答状况。目前临床上MRD的主要检测方法是：多参数流式细胞术(multiparametricflowcytometry，mpFC)和实时定量PCR技术。虽然mpFC对于复发疾病的检测灵敏度为10-4，但是复杂的多维数据依赖于实验人员分析，人为因素影响大，不利于临床标准化检测。此外，在化疗后白血病抗原的表达水平对MRD的mpFC检测具有干扰作用。依赖于分子手段可以提高检测MRD的灵敏度，可以达到10-5；然而，实时定量PCR需根据患者设计特殊的引物将多样性丰富的重排序列扩增出来，其检测费用昂贵、劳动力密集、很难形成标准化实验流程。得益于下一代高通量测序技术的快速发展和广泛应用，DNA和RNA测序平台在基因组学的各个方面发挥着突出的推动作用。因此，提供一种基于高通量测序构建白血病微小残留病灶TCR文库的多重PCR引物和方法。
技术实现思路
鉴于此，本专利技术提供了一种基于高通量测序构建白血病微小残留病灶TCR文库的多重PCR引物和方法。第一方面，本专利技术提供了一种基于高通量测序构建白血病微小残留病灶TCR文库的多重PCR引物，包括上游引物和下游引物，所述上游引物为比SEQIDNO:1～SEQIDNO:25所示的核苷酸序列多或少0～3个碱基的核苷酸序列组成的上游引物组；所述下游引物为比SEQIDNO:26～SEQIDNO:38所示的核苷酸序列多或少0～3个碱基的核苷酸序列组成的。如本专利技术所述的，“碱基”可代表核苷酸，比如，计数时，用1bp代表1个核苷酸。如本专利技术所述的，“多或少0～3个碱基”，优选为在对应引物的3’端多或少0～3个碱基。本专利技术通过针对人TCR的可变区V区(variable)设置至少25条上游引物序列，针对TCR的连接区(joining)J区设置至少13条下游引物序列，通过多重PCR扩增出目的链的PCR产物，获得高通量测序文库。本专利技术采用至少13条下游引物序列与所述至少25条上游引物序列随机组合成配对引物，然后进行多重PCR反应，扩增TCRCDR3区。优选地，所述上游引物为SEQIDNO:1～SEQIDNO:25所示的核苷酸序列组成的上游引物组，所述下游引物为SEQIDNO:26～SEQIDNO:38所示的核苷酸序列组成的下游引物组。如本专利技术所述的，所述比SEQIDNO:1～SEQIDNO:17所示的核苷酸序列多出的1～3个碱基为与目的TCR互补的碱基。如本专利技术所述的，本领域技术人员可以理解的，所述的“比SEQIDNO:1～SEQIDNO:25或SEQIDNO:26～SEQIDNO:38所示的核苷酸序列多或少0～3个碱基的核苷酸序列”为本领域技术人员在设计PCR引物时，在如“SEQIDNO:1～SEQIDNO:38所示的核苷酸序列”的基础上，适当的延长或截短PCR引物长度即可获得(延长部分仍然与相应的目的片段互补)；本领域技术人员可以理解的，若摸索的多重PCR引物组(“SEQIDNO:1～SEQIDNO:38所示的核苷酸序列”)获得了较佳的扩增效果，在可预测范围内，适当的将各条引物延长或截短0～3个碱基后所得多重PCR引物组，也可以获得较佳的多重PCR扩增效果。优选地，所述下游引物的5’端和上游引物的5’端分别包括标签序列，所述标签序列为由6～8个核苷酸序列组成的序列条码，其中，所述序列条码之间至少有一个核苷酸不同。本专利技术提供的带标签序列的引物可以给待测样品中的每个RNA分子或DNA分子都加上了一个标签序列，所述标签序列由ATCG四种基本碱基随机组合，且所述标签序列互不相同，例如，标签序列的碱基个数是八个时(本专利技术实施例中表示为8N标签序列)，可以获得109个不同的标签序列组合；标签序列的碱基个数是七个时，可以获得108个不同的标签序列组合；标签序列的碱基个数是六个时，可以获得107个不同的标签序列组合，所述标签序列的碱基个数是八个，或者七个，或者六个。第二方面，本专利技术提供了一种基于高通量测序构建白血病微小残留病灶TCR文库的多重PCR方法，包括如下步骤：取待测样品；采用多重PCR反应扩增待测样品获得多重PCR产物，其中，多重PCR反应采用的引物组包括上游引物和下游引物，所述上游引物为3’端比SEQIDNO:1～SEQIDNO:25所示的核苷酸序列多或少0～3个碱基的核苷酸序列组成的上游引物组；所述下游引物为3’端比SEQIDNO:26～SEQIDNO:38所示的核苷酸序列多或少0～3个碱基的核苷酸序列组成的。优选地，所述待测样品为DNA样品或RNA样品。当所述取待测样品为DNA样品时，进行多重PCR的体系参照普通PCR体系进行配置；当所述取待测样品为RNA样品时，要先进行逆转录合成cDNA，再合成第二链DNA，此时，逆转录合成cDNA的步骤相当于一个循环的多重PCR(只采用上游引物组或下游引物组)，合成第二链DNA的步骤也相当于一个循环的多重PCR(只采用下游引物组或上游引物组)。优选地，所述待测RNA样品为(优选采用RNA试剂盒)提取人外周血单个核细胞获得的总RNA。优选地，当待测样品为RNA样品，所述的采用多重PCR反应，扩增待测样品，获得多重PCR产物的步骤为：先以下游引物组为反转录引物合成cDNA；然后以合成的cDNA为模板，加入上游引物组，进行多重PCR，扩增cDNA，获得多重PCR产物。优选地，当待测样品为RNA样品，所述的采用多重PCR反应，扩增待测样品，获得多重PCR产物的步骤为：先以上游引物组为反转录引物合成cDNA；然后以合成的cDNA为模板，加入下游引物组，进行多重PCR，扩增cDNA，获得多重PCR产物。优选地，所述上游引物为SEQIDNO:1～SEQIDNO:25所示的核苷酸序列组成的上游引物组，所述下游引物为SEQIDNO:26～SEQIDNO:38所示的核苷酸序列组成的下游引物组。优选地，所述多重PCR反应的体系中，13条上游引物组成的上游引物组中，各上游引物等摩尔混合；4条下游引物组成的下游引物组中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于高通量测序构建白血病微小残留病灶TCR文库的多重PCR引物，其特征在于，包括上游引物和下游引物，所述上游引物为比SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:25所示的核苷酸序列多或少0～3个碱基的核苷酸序列组成的上游引物组；所述下游引物为比SEQ ID NO:26～SEQ ID NO:38所示的核苷酸序列多或少0～3个碱基的核苷酸序列组成的。

【技术特征摘要】
1.一种基于高通量测序构建白血病微小残留病灶TCR文库的多重PCR引物，其特征在于，包括上游引物和下游引物，所述上游引物为比SEQIDNO:1～SEQIDNO:25所示的核苷酸序列多或少0～3个碱基的核苷酸序列组成的上游引物组；所述下游引物为比SEQIDNO:26～SEQIDNO:38所示的核苷酸序列多或少0～3个碱基的核苷酸序列组成的下游引物组。2.如权利要求1所述的基于高通量测序构建白血病微小残留病灶TCR文库的多重PCR引物，其特征在于，所述下游引物的5’端和上游引物的5’端包括标签序列，所述标签序列为由6～8个核苷酸序列组成的序列条码，其中，所述序列条码之间至少有一个核苷酸不同。3.如权利要求1所述的基于高通量测序构建白血病微小残留病灶TCR文库的多重PCR引物，其特征在于，所述上游引物为SEQIDNO:1～SEQIDNO:25所示的核苷酸序列组成的上游引物组，所述下游引物为SEQIDNO:26～SEQIDNO:38所示的核苷酸序列组成的下游引物组。4.一种基于高通量测序构建白血病微小残留病灶TCR文库的多重PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：取待测样品；采用多重PCR反应扩增待测样品获得多重PCR产物，其中，多重PCR反应采用的引物组包括上游引物和下游引物，所述上游引物为3’端比SEQIDNO:1～SEQIDNO:25所示的核苷酸序列多或少0～3个碱基的核苷酸序列组成的上游引物组；所述下游引物为3’端比SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛良进，刘松，林群婷，刘丽春，曾立董，黄莎莎，黄亮，李改玲，
申请(专利权)人：深圳市瀚海基因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44