一种提高大豆发状根阳性转化率的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高大豆发状根阳性转化率的方法。本发明专利技术的方法包括如下步骤：1)将外源DNA导入植物外植体，得到转入后外植体；2)将所述转入后外植体依次经过发芽培养、恢复培养和诱导培养，得到转基因发状根；所述诱导培养的培养体系为含有草丁膦的培养体系。通过试验证明：本发明专利技术的方法降低了获得的发状根中非转基因发状根的数量和比例，提高了转基因发状根的比例，减少了后期的筛选、鉴定工作量，提高工作效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体设及。
技术介绍
大豆（GlycinemaxL.Merr.)是重要的粮油兼用作物，也是目前转基因品种种植 面积最大的作物。2013年，全球转基因大豆的种植面积已达8450万公顷，约占世界大豆种 植总面积的79%，转基因技术已成为大豆新品种培育的重要手段。目前使用较为广泛的大 豆转化体系，W根癌农杆菌介导的子叶节转化体系和基因枪介导的幼胚转化体系为主。但 两个转化体系均存在转化周期较长、转化效率较低等问题，不利于目标基因在大豆中育种 应用价值快速评估工作的开展。 近年来，随着基因功能分析研究需求的不断增加，发根农杆菌介导的大豆发状根 转化体系越来越受到重视。该转化体系具有转化周期短、转化效率高、单细胞分化而来的发 状根变异性低等突出优点。尽管目前尚不能用运种方法获得转基因再生植株，但已在固氮、 抗病、耐盐等与根系密切相关的基因功能分析和育种价值评价等方面发挥了重要作用。利 用适宜的培养条件，还可将诱导出的发状根进一步诱导出愈伤组织，从而进一步拓展基因 功能分析的范围。 常用的大豆发状根转化体系，在转化过程中不使用筛选剂对转化体进行筛选，尽 管能够产生较多的发状根，但由于其中非转化体的频率通常高达70%W上，后期需对其进 行大量的鉴定工作，识别出转基因发状根用于后续研究和工作，鉴定工作量巨大，费时、费 力。
技术实现思路
阳〇化]本专利技术的一个目的是提供一种使外源DNA导入植物产生发状根的方法。 本专利技术提供的使外源DNA导入植物产生发状根的方法包括如下步骤： 1)将外源DNA导入植物外植体，得到转入后外植体； 2)将所述转入后外植体进行诱导培养，得到带有发状根的外植体； 所述诱导培养的培养体系为含有草下麟的培养体系。 上述方法中，所述草下麟在所述培养体系中的浓度为1. 5-2. 5mg/L。 上述方法中，所述草下麟在所述培养体系中的浓度为2mg/L。 上述方法中，所述含有草下麟的培养体系为含有草下麟的1/2MS固体诱导培养 基。 上述方法中，所述含有草下麟的1/2MS固体诱导培养基为将草下麟、1/2MS液体培 养基和凝固剂混匀得到的培养基。 上述方法中，所述诱导培养的溫度为22-26°C ; 所述诱导培养的光量子为100-150mol/m2s; 所述诱导培养的光照周期为16h光照/她黑暗； 所述诱导培养的时间为23-27天。 上述方法中，在步骤1)和2)之间，还包括将所述转入后外植体进行恢复培养的步 骤。 所述恢复培养采用的培养基为1/2MS固体培养基，采用的培养条件为24°C、光量 子为100-150mol/m2s、光照周期为1化光照/化培养2d。 上述方法中，步骤1)中，所述外源DNA通过农杆菌介导导入植物外植体。 上述方法中，所述植物外植体为植物的子叶； 阳02引所述外源DNA为GUS基因； 所述外源DNA通过重组菌与所述植物外植体共培养，实现导入植物外植体。 上述方法中，所述重组菌为将重组载体pGFPGUS-bar导入农杆菌得到的菌； 阳0巧]所述重组载体pGFPGUS-bar为将bar基因表达盒插入表达载体的多克隆位点中得 到的载体。 上述方法中，所述农杆菌为发根农杆菌；所述发根农杆菌具体为发根农杆菌 K599 ;所述表达载体为pGFPGUSplus载体。 所述重组载体pGFPGUS-bar为将pGFPGUSplus载体的EcoRI和化〇I酶切位点 间的DNA片段替换为bar基因表达盒，且保持pGFPGUSplus载体的其他序列不变得到的载 体。 本专利技术的另一个目的是提供一种使外源DNA导入植物产生发状根的培养体系。 本专利技术提供的使外源DNA导入植物产生发状根的培养体系包括含有草下麟的 1/2MS固体诱导培养基；所述草下麟在所述含有草下麟的1/2MS固体诱导培养基中的浓度 为 1. 5-2. 5mg/L。 上述培养体系中，所述草下麟在所述含有草下麟的1/2MS固体诱导培养基中的浓 度为2mg/L。 本专利技术还有一个目的是提供上述方法或上述培养体系的新用途。 本专利技术提供了上述方法或上述培养体系在提高植物发状根的阳性转化率中的应 用。 上述应用中，所述发状根的阳性转化率的计算公式=导入外源DNA的发状根的个 数/发状根的个数。 上述方法或上述培养体系或上述应用中，所述植物为双子叶植物；所述双子叶植 物为大豆。 本专利技术提供了一种提高植物发状根的阳性转化率的方法。本专利技术将外源DNA导入 大豆子叶中，然后依次经过发芽培养、恢复培养和诱导培养，诱导培养的培养体系为含有草 下麟的培养体系，最后得到转基因发状根。通过试验证明：本专利技术的提高植物发状根的阳 性转化率的方法降低了发状根中非转基因发状根的数量和比例，提高了转基因发状根的比 例，减少了后期的筛选、鉴定工作量，提高工作效率。【附图说明】 图1为重组质粒pGFPGUS-bar的结构示意图。 图2为经过草下麟适宜筛选临界浓度筛选后所获发状根的GUS检测。其中，CK:非 转化发状根的GUS检测；A:吉林小粒I号巧：吉育47;C:中黄30。【具体实施方式】 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 下述实施例中的大豆品种吉林小粒1号：吉林省农业科学院于1979年W栽培品 种平顶四为母本，半野生大豆GD50477为父本，通过种间有性杂交，经系统选育而成。1988 年吉林省粮油食品进出口公司将该品系命名为吉林小粒1号，1990年经吉林省农作物品 种审定委员会认定推广。"吉林小粒1号"在国家农作物种质保存中屯、（依托单位为中国 农业科学院作物科学研究所）长期保存，可免费提供给国内从事大豆科研工作的研究人 员使用；"吉林小粒1号"在文献"吉林省农业科学院大豆研究所主编.中国大豆品种志 (1978-1992)，农业出版社，1993年5月第1版，96-97"中公开过；公众可从中国农业科学院 作物科学研究所获得。 下述实施例中的大豆品种吉林47(吉育47):吉林省农业科学院1990年W海交 8403-74为母本，Fl为父本进行有性杂交，采用系谱 法选育而成。1999年经吉林省农作物品种审定委员会审定推广，又名吉育47。"吉林47" 在国家农作物种质保存中屯、（依托单位为中国农业科学院作物科学研究所）长期保存，可 免费提供给国内从事大豆科研工作的研究人员使用；"吉林47"在文献"国农业科学院作物 科学研究所、吉林省农业科学院大豆研究中屯、主编.中国大豆品种志（1993-2004)，中国农 业出版社，2007年12月第1版，123"中公开过；公众可从中国农业科学院作物科学研究所 获得。 下述实施例中的大豆品种中黄30 :中国农业科学院作物科学研究所W中品661为 母本、中黄14为父本进行有性杂交，采用摘芙法选育而成。2006年通过国审，2009年通过 北京市审定，品种权号为CNA20060446. 5。"中黄30"在国家农作物种质保存中屯、（依托单 位为中国农业科学院作物科学研究所）长期保存，可免费提供给国内从事大豆科研工作的 研究人员使用；"中黄30"在文献"黄玉锋，王康宁.大豆中黄30栽培密度研究.宁夏农林 科技，2012, 53(04) :本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种使外源DNA导入植物产生发状根的方法，包括如下步骤：1)将外源DNA导入植物外植体，得到转入后外植体；2)将所述转入后外植体进行诱导培养，得到带有发状根的外植体；所述诱导培养的培养体系为含有草丁膦的培养体系。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：侯文胜，刘京，陈莉，韩天富，黄珊，孙石，吴存祥，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11