【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，具体涉及gma-mir396c基因在调控大豆耐盐能力及产量中的应用。
技术介绍
1、microrna(mirna)是真核生物中广泛存在的非编码小rna，通常为20-24nt，通过序列互补调节转录后基因表达，mir396在植物生长发育过程中发挥重要作用，能够调控植物叶、根、花等的发育以及果实或籽粒的大小等。例如在叶片发育方面，mir396在拟南芥叶片发育过程中积累，抑制grf活性，调节叶片中细胞数量，影响叶片大小。研究发现，拟南芥受到太阳uv-b辐射后，叶片减小，主要通过提高mir396活性，降低grf表达量来抑制叶细胞增殖，从而抑制叶片的生长。在根发育方面，atmir396a在拟南芥中过表达，降低grf靶基因的转录水平，导致根长显著变短；而用t-dna插入法获得mir396a表达量降低的atmir396a突变体——mir396a-1，根长比野生型幼苗的根长增加。另外，mir396表达量的改变还会造成植物不同组织的异常发育，如毛果杨ptc-mir396c前体在烟草中过表达，转基因烟草的部分子叶融合、缺失，叶状体改变，生长后期发育迟缓，大多数花不育。mir396在拟南芥中上调抑制grf基因在花器官中的表达，mir396过表达的拟南芥中，大约70％的花产生发育异常的雌蕊。在番茄中通过靶标模拟技术抑制mir396活性，使mir396a和mir396b都下调，导致番茄花朵、萼片和果实都明显变大。mir396也会影响籽粒的发育，如osmir396c过表达会使水稻籽粒减小，而其靶基因osgrf4的过表达会使水稻籽粒增大
2、从以上已有研究看，对植物mir396的功能解析多采用基因过表达的方式，也有很少的研究通过靶标模拟技术抑制mir396活性，分析对转基因植物的影响。而对大豆mir396的研究，目前mir396在大豆中的功能如何还不清晰。
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题是克服上述问题的缺陷和不足，提供大豆gma-mir396c基因在调控大豆耐盐能力、产量中的应用。
2、本专利技术的第一个目的是提供所述gma-mir396c基因的应用。
3、本专利技术第二个目的是提供一种调控提高大豆耐盐能力/产量的产品。
4、本专利技术第三个目的是提供一种调控提高大豆耐盐能力/产量的方法。
5、本专利技术上述目的通过以下技术方案实现。
6、为实现以上目的，本专利技术采用如下技术方案。
7、gma-mir396c基因在提高大豆耐盐能力/产量中的应用。
8、进一步的，通过基因过表达和基因编辑，创制mir396c前体过表达(pre-m96c-oe)、基于crispr-cas9的gma-mir396c编辑(mir396c-ge)转基因大豆，gma-mir396c的前体序列(pre-mir396c)
9、(caacaaguccuguuaugcuuuuccacagcuuucuugaacuucuuaugccuagugcaauuauugauguggcauagaaguuuaagaaaaauguggaaaaacaugucaaaucuaggacuu)所示，gma-mir396c的成熟序列(mir396c)(uuccacagcuuucuugaacuu)，靶向gma-mir396c的gdna序列，如seq id no.1所示：(taagaagttcaagaaagctg)。
10、pre-mir396c qrt-pcr分析的引物，包括pre-mir396c f/r、和、或gma-mir396c f；所述的pre-mir396c f/r正向引物(5′-3′)为：ggtcatgcttttccacagctt，反向引物(5′-3′)为：ttgccatattctcccacagc；所述的gma-mir396c f正向引物(5′-3′)为：ttccacagctttcttgaactt。
11、qrt-pcr内参基因引物，包括cons15 f/r，所述的cons15 f/r正向引物(5′-3′)为：taaagagcaccatgcctatcc，反向引物(5′-3′)为：tggttatgtgagcagatgcaa。
12、突变检测pcr引物，包括mir396c f/r；所述的mir396c f/r正向引物(5′-3′)为：atccacccttttaggacactc，反向引物(5′-3′)为：ccttccaattagaccaccatt。
13、一种调控大豆耐盐能力/产量的产品，包括任一所述的引物，和/或gma-mir396c的前体，和/或gma-mir396c的成熟序列，和/或gma-mir396c基因，和/或gdna序列。
14、一种调控提高大豆耐盐能力/产量的方法，通过对gma-mir396c基因进行基因编辑，创制基于crispr-cas9的gma-mir396c编辑(mir396c-ge)转基因大豆。进一步的，通过mir396c成熟序列被编辑，提高了转基因大豆的耐盐能力/产量。更进一步的，所述的耐盐能力包括苗期耐盐能力，和/或开花期耐盐能力和/或全生育期耐盐能力。
15、本专利技术通过mir396c前体过表达(pre-mir396c-oe)和基于crispr-cas9技术的gma-mir396c编辑(mir396c-ge)，分析对转基因大豆生长发育及盐胁迫响应的影响，发现mir396c-ge的株高、茎粗、地上部干重、荚数、粒数、单行产量、百粒重显著增加，耐盐能力提高；而pre-mir396c-oe与之相反，其株高、茎粗、地上部干重、荚数、粒数减少，单行产量、百粒重降低，耐盐能力降低。
16、本专利技术创新的公开了mir396c前体过表达(pre-mir396c-oe)和基于crispr-cas9的gma-mir396c编辑(mir396c-ge)转基因大豆。与空载对照相比，mir396c-ge耐盐能力提高，正常条件下，mir396c-ge的株高、茎粗、地上部干重、荚数、粒数、单株产量、百粒重显著增加；与之相反，pre-mir396c-oe耐盐能力降低，正常条件下，pre-mir396c-oe的株高、茎粗、地上部干重、荚数、粒数减少，单株产量、百粒重降低。说明gma-mir396c基因具有调控大豆耐盐能力和产量性状提高的分子功能，为高产、耐盐大豆品种培育提供重要的候选基因，同时gma-mir396c基因编辑材料的创制，为高产、耐盐大豆品种培育提供重要的种质材料。
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1.Gma-MIR396c基因在提高大豆耐盐能力/产量中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，通过基因编辑，创制gma-MIR396c编辑(MIR396c-GE)转基因大豆，靶向Gma-MIR396c的gDNA寡核苷酸序列，如SEQ ID No.1所示。
3.Pre-miR396c qRT-PCR分析的引物，其特征在于，包括Pre-miR396c F/R、和、或Gma-miR396c F；所述的Pre-miR396c F/R正向引物(5′-3′)为：
4.qRT-PCR内参基因引物，其特征在于，包括Cons15 F/R，所述的Cons15 F/R正向引物(5′-3′)为：TAAAGAGCACCATGCCTATCC，反向引物(5′-3′)为：
5.突变检测PCR引物，其特征在于，包括miR396c F/R；所述的miR396c F/R正向引物(5′-3′)为：ATCCACCCTTTTAGGACACTC，反向引物(5′-3′)为：
6.一种调控大豆耐盐能力/产量的产品，其特征在于包括权利要求2至5中任一所述的引物
7.一种调控提高大豆耐盐能力/产量的方法，其特征在于，通过对gma-MIR396c基因进行基因编辑，创制gma-MIR396c编辑大豆(MIR396c-GE)。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，通过miR396c的成熟序列被编辑，提高了转基因大豆的耐盐能力/产量。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的耐盐能力包括苗期耐盐能力，和/或开花期耐盐能力和/或全生育期耐盐能力。
...【技术特征摘要】
1.gma-mir396c基因在提高大豆耐盐能力/产量中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，通过基因编辑，创制gma-mir396c编辑(mir396c-ge)转基因大豆，靶向gma-mir396c的gdna寡核苷酸序列，如seq id no.1所示。
3.pre-mir396c qrt-pcr分析的引物，其特征在于，包括pre-mir396c f/r、和、或gma-mir396c f；所述的pre-mir396c f/r正向引物(5′-3′)为：
4.qrt-pcr内参基因引物，其特征在于，包括cons15 f/r，所述的cons15 f/r正向引物(5′-3′)为：taaagagcaccatgcctatcc，反向引物(5′-3′)为：
5.突变检测pcr引物，其特征在于，包括mir396c f...
【专利技术属性】
技术研发人员：姜奇彦，姜雪敏，胡正，孙现军，张辉，王世佳，王伟妮，张豪强，糜欣苑，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：
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