腺病毒体制造技术

本发明专利技术涉及其中编码蛋白V的基因和/或编码蛋白VII的基因被置于异源启动子的控制下的重组腺病毒核酸，涉及其中腺病毒核苷酸序列以使其不再能够产生外壳蛋白中的一种或多种外壳蛋白的方式突变的重组腺病毒核酸，涉及填充有此类腺病毒物质的细胞囊泡、提供有此类腺病毒物质的细胞，并且涉及它们的方法和用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】腺病毒体
本专利技术涉及其中编码蛋白V的基因和/或编码蛋白VII的基因被置于异源启动子的控制下的重组腺病毒核酸，涉及其中腺病毒核苷酸序列以使其不再能够产生外壳蛋白中的一种或多种外壳蛋白的方式突变的重组腺病毒核酸，涉及填充有此类腺病毒物质的细胞囊泡、提供有此类腺病毒物质的细胞，并且涉及它们的方法和用途。
技术介绍
基因治疗是一种其中将遗传物质引入到细胞中的治疗方法，在细胞中其可取代缺陷基因或在细胞中其编码治疗分子(诸如细胞因子)或治疗抗体的表达。使用合适的媒介物(诸如病毒载体)将这些基因递送到细胞中。病毒载体具有通过将其DNA插入细胞并复制到细胞中而感染细胞的天然能力。腺病毒通常用作病毒载体。腺病毒是一种与呼吸道感染和结膜炎相关的充分表征的无包膜病毒。(Chu,R.L.,ClinicalCancerResearch,2004,10,5299-5312)。腺病毒是特别合适的病毒载体，因为它们既能够感染复制细胞也能够感染静止细胞，能够携带大片段DNA(高达30kbp)并且不整合到宿主细胞的基因组中。此外，可获得广泛的分子生物学知识，并且病毒可被有效地纯化至高滴度。存在腺病毒的不同亚型，其中2型和5型最常用于递送媒介物目的。完全成熟的人腺病毒5型病毒颗粒约为110纳米，形状为二十面体，并且含有由衣壳包围的包含双链DNA的核。形成衣壳的主要蛋白为六邻体、五邻体和纤维蛋白，但衣壳还包括蛋白IIIa、VI、VIII和IX。本文中，纤维蛋白有利于与宿主细胞受体诸如柯萨奇-Ad受体(CAR)的结合。此外，发现蛋白IX在病毒颗粒的稳定性中起作用。(Lee,C.S.等人Genes&Diseases,2017,4,43-63)。病毒的核由大小为36kb的双链线性DNA基因组和蛋白IVa2、V、VII、末端蛋白、μ和腺病毒蛋白酶组成。基因组由参与病毒DNA复制的早期基因E1A、E1B、E2、E3和E4、编码衣壳蛋白的中间基因pIX和IVa2和晚期基因L1至L5、以及核蛋白V和VII组成。为了提高病毒载体的安全性，已经开发了不同的世代，每个世代包含对基因组的特异性修饰或缺失，从而改变病毒复制自身或诱导免疫应答的能力。第一代腺病毒包含E1区域的缺失，以使病毒复制缺乏。然而，此类腺病毒载体的使用仍导致强免疫应答，这与高细胞毒性相关联。因此，开发了第二代病毒载体，其中除E1区之外，还在E2和/或E4基因中进行特异性突变或缺失。虽然免疫应答显著降低，但仍观察到细胞毒性副作用。因此，开发了第三代或无肠腺病毒载体，其中编码复制所需的酶或蛋白的所有基因被消除。然而，此类病毒带来纯化问题，因为它们需要存在合适的辅助病毒。(Jounaidi,Y,CurrCancerDrugTargets.2007,7(3),285-301)。在癌症治疗中，溶瘤病毒诸如条件复制腺病毒(CRAd)已成为选择性靶向癌细胞的强大工具。这种效果可以不同的方式实现。首先，可在病毒DNA中引入特异性突变，诸如E1a基因中24个碱基对的缺失(AdΔ24)或E1b-55kDa基因的缺失(AdΔ1520)，这导致CRAd在健康细胞中的复制被禁止，而在癌细胞中这种突变被细胞缺陷补偿，从而导致病毒的复制并因此导致癌细胞的裂解。另选地，可将E1基因置于癌症特异性启动子之下以使得E1区域受控制的转录，从而导致病毒颗粒仅在癌细胞中选择性复制。(Yamamoto,M,Curiel,D.T.,MolecularTherapy2010,18(2),243-250)此外，在癌细胞裂解时，溶瘤病毒颗粒被释放，其随后可感染相邻(未感染)癌细胞。这种现象被称为旁观者效应，并且有助于改善治疗效果。(Lee,C.S.等人，Genes&Diseases,2017,4,43-63)然而，腺病毒载体用于基因治疗仍然与主要缺点相关联。例如，由于它们的大尺寸、对细胞的“粘性”、不能经由血液转移、被抗体中和以及结合/摄取到细胞诸如红细胞或肝巨噬细胞中，因此有效递送特别是向转移的肿瘤递送仍然是一个挑战。细胞外囊泡(EV)是由尺寸通常在约50nm至1000nm范围内的脂质双层制成的细胞器，其从细胞分泌。它们可通过质膜向外出芽(包括凋亡泡)或通过内体膜向内出芽而形成，从而产生多囊泡单元，其继而在与质膜(外来体)融合时释放囊泡。EV通常包含不同种类的运载物，这取决于供体细胞。此类运载物可作为来自细胞的废物进行处理，并因此可由EV处理掉，或者其可用于细胞间通讯，即通过将运载物从一个细胞递送到另一个细胞。(vanderPol,E等人，PharmacologicalReviews,64(3),676-705；Maas,S.等人，JournalofControlledRelease,2015,200,87-96)此外，肿瘤来源的EV在动物模型中显示通过与相邻细胞及其局部微环境主动通信而在肿瘤进展和转移中起关键作用。肿瘤EV被认为经由若干途径影响免疫系统稳态，尤其是通过抑制CD8+T细胞介导的肿瘤靶向或抑制NK细胞，从而为肿瘤创造保护性微环境。此外，EV似乎促进血管募集以改善氧气供应并促进肿瘤细胞释放到循环中和它们扩散到其他部位。(Becker,A.,CancerCell,2016,30,836-848)。此外，EV可为组织特异性的，这取决于它们的表面蛋白组成。例如，在肿瘤分泌的EV上表达的特定整联蛋白导致对特定细胞类型的粘附。(Hoshino,A.等人，Nature.2015,527(7578):329-335；Costa-Silva,B,NatCellBiol.2015,17(6):816-826)。由于其将生物内容物转移到受体细胞中的天然能力及其靶标特异性，近年来已出现了开发EV作为治疗媒介物的兴趣。事实上，使用EV作为治疗媒介物提供了许多益处。由于它们天然存在于生物系统中，因此它们能够更深地渗透到组织中，从而改善递送效率。此外，它们能够通过血脑屏障并且因此可用作驻留在脑中的靶标的递送媒介物。另外，EV能够躲避免疫系统，从而减少EV从系统中的清除，并且EV不诱导免疫原性应答。然而，还没有建立有效负载EV和包装大DNA构建体的可靠和可再现的方法。一般来讲，使用电穿孔或超声处理将小核酸(例如，短发夹RNA)引入到EV中。这些方法效率低，并且研究甚至已报道此类策略不导致在EV内的真实包装，而仅导致在外部的聚集。(Kooijmans等人JControlRelease.2013年11月28日；172(1):229-238)。因此，仍然需要与腺病毒载体相比表现出改善的递送特性和降低的毒性但具有类似的堆积效率和负载大DNA片段的能力的媒介物。
技术实现思路
本专利技术人惊奇地发现，当用腺病毒感染细胞时，可获得名为“腺病毒体(adenosome)”的新颗粒，其由负载了腺病毒核级分(即，与病毒核蛋白组合的病毒基因组)的细胞囊泡组成。腺病毒体组合了细胞囊泡的有利特性和腺病毒的有利特性本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.重组腺病毒核酸，所述重组腺病毒核酸在早期基因中具有突变，其中编码蛋白V的基因和/或编码蛋白VII的基因被置于异源启动子的控制下。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180917 NL 20216481.重组腺病毒核酸，所述重组腺病毒核酸在早期基因中具有突变，其中编码蛋白V的基因和/或编码蛋白VII的基因被置于异源启动子的控制下。


2.根据权利要求1所述的重组腺病毒核酸，其中所述突变为E1a区中的Δ24突变和/或E1b区中的Δ55k突变。


3.根据前述权利要求中任一项所述的重组腺病毒核酸，其中所述重组腺病毒核酸为条件复制型腺病毒和/或复制缺陷型腺病毒载体的腺病毒核酸。


4.根据前述权利要求中任一项所述的重组腺病毒核酸，其中插入了异源基因。


5.细胞囊泡，所述细胞囊泡包含根据前述权利要求中任一项所述的重组腺病毒核酸。


6.细胞囊泡，所述细胞囊泡包含其中所述编码蛋白V的基因和/或所述编码蛋白VII的基因被置于异源启动子的控制下的重组腺病毒核酸。


7.根据权利要求6所述的细胞囊泡，还包含异源基因。


8.根据权利要求6所述的细胞囊泡，还包含在早期基因中具有突变的腺病毒核酸。


9.根据权利要求7所述的细胞囊泡，包含
-包含其中所述编码蛋白V的基因和/或所述编码蛋白VII的基因被置于异源启动子的控制下的所述重组腺病毒核酸的核酸分子，以及所述异源基因；或者
-包含其中所述编码蛋白V的基因和/或所述编码蛋白VII的基因被置于异源启动子的控制下的所述重组腺病毒核酸的核酸分子，以及包含所述异源基因的核酸分子。


10.细胞囊泡，所述细胞囊泡包含腺病毒蛋白V和/或蛋白VII以及
-包含在早期基因中具有突变的重组腺病毒核酸的核酸分子，和/或
-异源基因。


11.根据权利要求1至10中任一项所述的重组腺病毒核酸或细胞囊泡，其中所述腺病毒核酸以使得其不再能够产生主要衣壳蛋白中的一种或多种主要衣壳蛋白的方式突变。


12.根据权利要求11所述的重组腺病毒核酸或细胞囊泡，其中编码所述主要衣壳蛋白的晚期基因中的一种或多种晚期基因从所述核苷酸序列部分或完全缺失。


13.根据权利要求1至10中任一项所述的重组腺病毒核酸或细胞囊泡，其中晚期基因中的一种或多种晚期基因被置于表达调节子的控制下，所述表达调节子优选地为用于强力霉素可控基因表达的Tet-On或Tet-Off系统。


14.根据权利要求1至10中任一项所述的重组腺病毒核酸或细胞囊泡，其中所述腺病毒核酸以使得其不再能够被包装在腺病毒衣壳中的方式突变，优选地通过loxP位点侧接腺病毒包装(psi)以建立所述序列的基于Cre重组酶的缺失。


15.根据权利要求1至14中任一项所述的重组腺病毒核酸或细胞囊泡，其中所述异源启动子为早期腺病毒启动子。


16.根据权利要求1至14中任一项所述的重组腺病毒核酸或细胞囊泡，其中所述启动子为蛋白IX的中间启动子。


17.根据权利要求1至14中任一项所述的重组腺病毒核酸或细胞囊泡，其中所述启动子为非腺病毒来源的异源启动子，优选地磷酸甘油酸激酶(PGK)或巨细胞病毒启动子。


18.根据权利要求1至17中任一项所述的重组腺病毒核酸或细胞囊泡，其中蛋白V和/或蛋白VII与异源分子特别是治疗蛋白、成像蛋白或允许纯化的蛋白融合。


19.根据权利要求18所述的重组腺病毒核酸或细胞囊泡，其中所述异源分子选自包含以下各项的组：绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、用于磁性分离的亲和标签、SNAP标签、生物素酰化序列。


20.根据权利要求4至19中任一项所述的重组腺病毒核酸或细胞囊泡，其中所述异源基因编码选自包含以下各项的组的生物分子：前药转化酶，优选地胸苷激酶；细胞因子，优选地GM-CSF、IL-2或IL-12；检查点抑制...

【专利技术属性】
技术研发人员：杰罗恩·德夫里吉，
申请(专利权)人：鹿特丹伊拉斯姆斯大学医疗中心，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL