一种通过气管内途径转染的基因在肺组织中高表达的动物模型的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种通过气管内途径转染的基因在肺组织中高表达的动物模型的制备方法。其包括以下步骤：(1)构建携带血管内皮生长因子A的重组病毒载体，并调整病毒滴度为0.5～2×10

【技术实现步骤摘要】
一种通过气管内途径转染的基因在肺组织中高表达的动物模型的制备方法
本专利技术属于动物模型制备
，具体涉及一种通过气管内途径转染的基因在肺组织中高表达的动物模型的制备方法。
技术介绍
基因干预技术是目前临床疾病基础研究的热门技术，该技术通过基因转染能够达到提高或抑制目的基因在组织或细胞内表达的目的，从而对更深入研究目的基因在相关疾病发病机制中的作用具有重要意义。腺病毒载体是基因干预技术的重要媒介，携带目的基因的腺病毒穿梭质粒与携带腺病毒基因组的包装质粒共转染HEK293细胞，通过Cre/loxP重组酶系统的作用产生重组腺病毒，感染分裂期和非分裂期细胞，表达目的基因，而腺病毒基因组不整合到宿主细胞染色体内，不能复制，因而是安全、有效的基因载体。新生大鼠是新生儿疾病基础研究的重要模型动物。利用新生大鼠建立新生儿呼吸系统疾病的基因干预模型常需要将目的基因或其干扰基因片段整合到新生大鼠肺组织中，携带目的基因的腺病毒载体是目前常用的转染媒介，而如何将腺病毒载体转染至肺脏是其关键技术。经尾静脉途径转染腺病毒能够到达肺脏，使目的基因在肺组织内表达，然而新生大鼠体质量小，尾静脉纤细，穿刺困难，且尾静脉血量极少，回血不明显，需注入少量药物才能判断是否穿刺成功，而一旦穿刺不成功，重复穿刺，反复注射药物，可造成尾部水肿，进一步增加了穿刺难度，降低了穿刺成功率，而且反复穿刺造成药物剂量把控困难以及药物浪费，因此为了提高穿刺成功率，研究人员常需等待新生大鼠达到一定的体质量后才开始实验，限制了实验进程。气管内给药是将药物达到肺脏的另一重要途径，然而通过气管内途径实现重组腺病毒载体在新生大鼠肺组织内靶向转染未见相关报道。
技术实现思路
针对现有技术中的上述不足，本专利技术提供一种通过气管内途径转染的基因在肺组织中高表达的动物模型的制备方法，可构建一种通过气管内途径实现重组腺病毒载体在新生大鼠肺组织内靶向转染的动物模型。为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种通过气管内途径转染的基因在肺组织中高表达的动物模型的制备方法，包括以下步骤：(1)构建携带血管内皮生长因子A的重组病毒载体，并调整病毒滴度为0.5～2×1011PFU/mL；(2)将动物麻醉后悬挂固定，然后照射其颈部，并打开其口腔然后插入气管导管，再将病毒经气管导管注入至动物肺组织中，然后接入呼吸机直至动物清醒，最后拔除气管导管即可。进一步地，重组病毒载体为重组腺病毒载体，其包括元件顺序为CMV-MCS-3FLAG-SV40-EGFP的载体质粒GV314，以及辅助包装质粒。进一步地，重组病毒载体的构建过程为：(1)VEGF-A过表达腺病毒载体构建：载体名称为GV314(元件顺序：CMV-MCS-3FLAG-SV40-EGFP)，BamHI/AgeI酶切将载体线性化，通过PCR法扩增目的基因人源化VEGF-A，扩增引物如下所示；VEGFA(4907-1)-P1:AGGTCGACTCTAGAGGATCCCGCCACCATGAACTTTCTGCTGTCTTGG；(SEQIDNO.1)VEGFA(4907-1)-P2:TCCTTGTAGTCCATACCCCGCCTCGGCTTGTCAC(SEQIDNO.2)；(2)腺病毒包装与检测主要过程为携带外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带腺病毒大部分基因组(E1/E3缺失)的辅助包装质粒pBHGloxΔE1,3Cre共转染HEK293细胞，产生携带外源基因的非复制型重组腺病毒。用0.25％胰蛋白酶消化HEK293细胞，培养至细胞密度达到50-60％时进行转染。将腺病毒穿梭质粒和辅助包装质粒各5μg与DMEM培养基混合均匀，与阳离子脂质体组成复合物室温下孵育。将复合物转染HEK293细胞，继续培养，待大部分细胞出现病变时收集病毒。将生长状态良好的HEK293细胞传入T25细胞培养瓶中，加入病毒，2次扩增后进行纯化、收集以及保存。将纯化后的病毒对其物理状态、无菌状态及病毒滴度进行检测，病毒滴度为1×1011(PFU/ml)。进一步对，气管导管的制备过程为：取4.5F头皮针，去除延长管，针芯前端连接PE50导管，超出针芯约1.5～2.0cm；截取1.9F中心静脉导管针芯前端，插入头皮针内部(插入深度短于PE50导管前端)，一方面延长了气管导管长度便于操作，另一方面增加了PE50导管前端硬度，便于插入新生大鼠气管内，自制气管导管完成后浸泡于75％酒精中备用，见图2。进一步地，动物模型为新生大鼠模型或成年大鼠模型。进一步地，步骤(2)的具体过程为：(1)取造模用新生大鼠20-30g，用氯胺酮(100mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)腹腔内麻醉，待麻醉生效后行气管插管术。(2)将新生大鼠前门齿悬挂、背部紧贴于三脚支架固定新生大鼠，LED灯面向新生大鼠头面部照射颈部，用气管导管测量前门齿至喉部的体表距离，并做标记。(3)操作者面向新生大鼠背部，左手从大鼠左侧嘴角向外上方拉出舌，于喉部正中可见一2mm左右大小的光点，可随呼吸运动张开与闭合，即为声门部位，右手持自制气管导管，插入声门至导管标记处，固定气管导管。(4)每只新生大鼠需转染腺病毒2×108PFU，因制备的腺病毒载体滴度为1×1011(PFU/ml)，故用移液枪吸取腺病毒转染原液2μL，用PBS稀释至25μL后注入气管导管内。(5)放置新生大鼠于平卧位，连接小动物呼吸机促进药物弥散至肺内并维持呼吸稳定，待新生大鼠麻醉清醒后撤机，拔除气管导管。(6)新生大鼠转染重组腺病毒24h后提取肺、肝、脾、肾脏等组织，制作冰冻切片，并制作肺组织石蜡切片，鉴定转染效果。本专利技术的有益效果为：从新生大鼠左侧口角向外上方拉出舌体，经LED灯照射颈部，即可暴露声门，无需使用专用喉镜，将气管导管插入声门后即可注入病毒转染液，操作方法简单，操作成功率高，且气管导管为自制导管，花费少，因而该方法实用性好。由于新生大鼠体质量对喉口直径影响小，但体质量对尾静脉直径影响较大，因此新生大鼠体质量较小时气管插管成功率明显高于尾静脉穿刺，因此新生大鼠体质量对本技术影响相对小于尾静脉穿刺，加快了实验进程；另外自制气管导管，不仅操作方便而且花费少，利用LED灯照射颈部，无需借助专用喉镜，降低了实验成本，经济实用性好。另外，经气管内注入病毒转染液，本技术提供了合适的病毒量，病毒载体可直接到达肺泡上皮，并通过旁分泌、血液循环弥散至肺脏血管等部位，实现了目的基因在肺组织内靶向转染，提高了转染效果。本申请经气管内转染腺病毒载体，病毒量合适，肺脏以外其他脏器转染率低下，提高了转染靶向性。另外通过气管内转染携带VEGF-A的重组腺病毒载体，提取新生大鼠肺组织行免疫组化结果表明VEGF-A表达升高，免疫组化结果也显示VEGF-A能够定位在肺血管内皮，进一步验证了该技术的有效性。也可以为新生儿呼吸系统疾病基因方面的基础研究方法提供了一定的借鉴。附图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通过气管内途径转染的基因在肺组织中高表达的动物模型的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)构建携带血管内皮生长因子A的重组病毒载体，并调整病毒滴度为0.5～2×10

【技术特征摘要】
1.一种通过气管内途径转染的基因在肺组织中高表达的动物模型的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建携带血管内皮生长因子A的重组病毒载体，并调整病毒滴度为0.5～2×1011PFU/mL；
(2)将动物麻醉后悬挂固定，然后照射其颈部，并打开其口腔然后插入气管导管，再将病毒经气管导管注入至动物肺组织中，然后接入呼吸机直至动物清醒，最后拔除气管导管即可。


2.根据权利要求1所述的通过气管内途径转染的基因在肺组织中高表达的动物模型的制备方法，其特征在于，所述重组病毒载体为重组腺病毒载体，其包括元件顺序为CMV-MCS-3FLAG-SV40-EGFP的载体质粒GV314，以及辅助包装质粒。


3.根据权利要求1所述的通过气管内途径转染的基因在肺组织中高表达的动物模型的制备方法，其特征在于，所述气管导管的制备过程为：
取4.5F头皮针，去除延长...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹静，李明霞，王乐，杨梅，赵倩，吴典，
申请(专利权)人：新疆医科大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：新疆;65