一种治疗肝癌的含IL12双顺反子的病毒构建体及其用途和构建方法技术

本申请涉及一种治疗肝癌的病毒构建体及其用途和构建方法。本发明专利技术还涉及一种个体化靶向治疗肝癌新型溶瘤病毒及其构建方法。本发明专利技术的构建体以有效连接的方式包含AFP启动子、RGD‑4C基因、IL‑12‑p40基因、IRES基因和IL‑12‑p35基因以及任选的谷氨酰转肽酶基因和肿瘤相关抗原基因。

【技术实现步骤摘要】
一种治疗肝癌的含IL12双顺反子的病毒构建体及其用途和构建方法
：本专利技术涉及生物技术和基因治疗领域，具体的说，本专利技术涉及一种治疗肝癌的含IL12双顺反子的病毒构建体及其用途和构建方法。本专利技术还涉及一种个体化靶向治疗肝癌新型溶瘤病毒及其构建方法。
技术介绍
：肝癌指的是肝脏的恶性肿瘤，一般分为两大类：即原发性肝癌和继发性肝癌两大类。原发性肝癌起源于肝脏的上皮或间叶组织，在我国属于高发性癌症；相比较原发性肝癌，继发性或转移性肝癌主要指已转移身体各个器官的肿瘤入侵至肝脏的癌症。诱发肝癌的原因很多，如乙型与丙型肝炎病毒的感染，饮用水污染、化学物质致癌、免疫失调以及其他复杂因素等。目前对于癌症的治疗主要有以下几种手段：手术治疗、姑息性外科治疗、多模式综合治疗、无水酒精瘤内注射、放射治疗、导向治疗、肝动脉栓塞化疗、放疗和生物治疗等。其中生物治疗是目前除手术、化疗、放疗外的第四大肝癌治疗方法。但是生物治疗的手段屈指可数，其中的免疫治疗方法，通过分离抗癌免疫细胞，进行体外培植再回注到患者体内，达到自身免疫的效果；还有用于肝癌的靶向药物，如2016年5月通过FDA审核的乐伐替尼已经作为肝癌全身治疗的一线用药。乐伐替尼的主要靶点有VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、FGFR1、PDGFR、cKit、Ret，通过抑制肿瘤生成和抑制血管形成等细胞活动抑制肿瘤发生发展。根据临床效果显示乐伐替尼的有效率为24％，中位无进展生存期为7.4个月，中位总生存期为13.6个月。尽管如此，肝癌的死亡率在全球范围内依旧居高不下，研究更为有效的肝癌治疗方法是立在必行的方向。白细胞介素12(interleukin-12,IL-12),又称自然杀伤细胞刺激因子(NKSF)或细胞毒淋巴细胞成熟因子(CLMF),它具有众多的生物学功能,尤其在肿瘤免疫治疗方面显示毒副作用小,抗肿瘤生成及转移活性高,有望开发成治疗肿瘤的新药(唐冬生等，1999),IL-12是一种重要的参与免疫调节的细胞因子,它主要是由巨噬细胞、树突状细胞等抗原提呈细胞产生的一种异二聚体细胞因子，双亚基必须同时在一个哺乳细胞内表达才能产生有完整生物学活性的IL-12。IRES为微小RNA病毒类中5'端非翻译区中的一段序列,它可直接引入核糖体大小亚基对其后的结构基因进行翻译。IRES这一特点,可应用于构建同时表达两个基因的双顺反子真核表达载体,尤其在进行IL-12的真核表达时,IRES的应用更有意义,因为形成具有完整的生物学功能的IL-12需要p40和p35双亚基等分子数表达,如果p40过量表达,游离p40形成p40同亚基二聚体,它是IL-12的抑制剂,拮抗IL-12的生物学活性,下调机体的细胞免疫作用,所以用IRES串联p40和p35亚基进行IL-12的真核表达可有效获得重组IL-12(高军，2004)。甲胎蛋白(Alphafetoprotein,AFP)是一种主要在肝癌细胞表达的分泌蛋白，本专利技术利用肝癌特异性表达AFP的特点构建靶向在肝癌细胞感染繁殖的新型溶瘤病毒Ade-PDC316-AFP-RGD-4C-IL-12-p40-IRES-IL-12-p35-GT-TAA，该病毒不感染正常肝细胞及其它正常组织，靶向用药，具有高效/特异性强等特点，该病毒同时具有增加病毒复制和调节增加细胞免疫等特点。溶瘤病毒疗法是一种通过病毒选择性感染肿瘤细胞来杀伤肿瘤的新型肿瘤治疗方法。溶瘤病毒是具有复制能力的肿瘤杀伤性病毒，但这种病毒对正常细胞不造成影响，其主要通过刺激机体残生特异性肿瘤免疫反应杀死肿瘤。目前溶瘤病毒主要分为两大类，一类是天然对于肿瘤细胞具有特异性感染或杀伤能力的病毒，如呼肠孤病毒，新城疫病毒等；另一类是经过人工改造过的，对肿瘤具有特异性杀伤能力并在肿瘤中复制的病毒，如腺病毒、单纯疱疹病毒、流感病毒和人牛痘病毒等。溶瘤病毒(OVs)在不损害正常组织的情况下，选择性地复制并杀死癌细胞，并在肿瘤内传播。除了这种直接的溶瘤活性，OVs在诱导自身和受感染肿瘤细胞的免疫反应方面也非常有效。OVs包含广泛的DNA和RNA病毒的多样性，这些病毒天生具有癌症选择性，或者可以通过基因工程实现。OVs为免疫治疗提供了多样化的平台；它们起着原位疫苗的作用，可以用免疫调节基因武装起来，也可以与其他免疫疗法结合使用。国内外的发展动态：目前已有3个溶瘤病毒产品获批上市，T-vec(Talimogenelaherparepvec,Imlygic)是目前FDA批准上市的唯一一个溶瘤病毒产品，来源于HSV-1病毒，其被改造删除了ICP34.5和ICP47两个基因，前者会抑制细胞蛋白的翻译，后者会抑制抗原递呈，于2015年10月获批上市用于晚期黑色素瘤的治疗。2004年拉脱维亚获批的RIGVIR，用于治疗多种癌症，其中约75％的黑色素瘤患者接受了RIGVIR疗法；2005年国内首个获批的溶瘤病毒产品H101主要用于治疗原发灶、临床晚期和复发性的头颈部肿瘤。目前OVs进入临床I/II等评估阶段的产品有Pexa-Vec治疗肝癌和结直肠癌、TG6002/5-FC联用治疗脑胶质瘤以及LOAd703治疗胰腺癌等。Pexa-Vec(JX-594)是一种表达GM-CSF的溶瘤性牛痘病毒，已经在肝细胞癌(HCC)患者中完成了随机II期试验。JX-594的抗癌免疫发生在JX-594复制和GM-CSF表达后。目前CFDA批准JX-594用于治疗晚期肝癌，李氏大药厂已经开展全球性临床三期研究，这项随机研究将在北美、亚洲、澳洲、欧洲以及中国开展。此外，2017年5月，美国FDA授予oncolyticsBiotech公司产品Reolysin，对转移性黑色素瘤患者静脉注射溶瘤病毒的快速通道认证。Toca511是一种注射型的逆转录病毒载体，TocaFC为一种在研的延长释放型的5-FU类药物。FDA已经授予Toca511和TocaFC联用治疗高级别神经胶质瘤的突破性疗法认定。目前已经完成II期临床患者的招募工作。DNAtrix公司正在与默克合作商讨DNX-2401的效率和安全性评估，用于联合pembrolizumab进行抗PD-1的治疗。应用前景：溶瘤病毒可以通过自身表达免疫检查点抑制剂、肿瘤抗原、细胞因子和T细胞衔接器等方式克服肿瘤细胞的屏障抑制肿瘤的发展。溶瘤病毒作为协同抗癌的新疗法已经被广泛认可，很多溶瘤病毒产品已经进入临床阶段。溶瘤病毒有许多特点，使其具有优势和区别于当前的治疗方式：(i)产生耐药性的可能性很低(迄今未见)，因为OVs通常针对多种致癌途径，并采用多种方法进行细胞毒性；(ii)它们以肿瘤选择性的方式进行复制，是非致病性的，只检测到最小的系统毒性；(iii)由于原位病毒扩增，肿瘤中的病毒剂量随时间增加，而传统药物药代动力学随时间减少；(iv)可内置安全功能，如药物和免疫敏感性。这些特征会导致很高的治疗指数。例如申请号20180904522.2，公布日期为2019年01月08日，专利技术名称《一种选择性杀灭肝癌细胞的新型溶瘤病毒及其构建方法》的中国专利技术专利申请，通过将I型单纯疱疹病毒17+株基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种治疗肝癌的病毒构建体，其以有效连接的方式包含：/n(a)核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的AFP启动子、/n(b)RGD-4C基因、/n(c)核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的IL-12-p40基因、/n(d)核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的IRES基因、和/n(e)核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的IL-12-p35基因。/n

【技术特征摘要】
1.一种治疗肝癌的病毒构建体，其以有效连接的方式包含：
(a)核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的AFP启动子、
(b)RGD-4C基因、
(c)核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的IL-12-p40基因、
(d)核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的IRES基因、和
(e)核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的IL-12-p35基因。


2.权利要求1的病毒构建体，其中(b)RGD-4C基因的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。


3.权利要求1的病毒构建体，其为腺病毒构建体。


4.权利要求1的病毒构建体，其还包含(f)谷氨酰转肽酶基因和肿瘤相关抗原基因。


5.权利要求1-4中任一项的病毒构建体，其以5’至3’的方向包含组件(a)、(b)、(c)、(d)、(e)以及任选的(f)。


6.权利要求1-5中任一项的病毒构建体在制备用于在患者中治疗癌症的药物中的用途。


7.权利要求6的用途，其中所述癌症是肝癌，例如肝细胞癌。


8.一种构建权利要求1-5中任一项的病毒构建体方法，其特征在于，包括以下步骤：
将增加病毒复制的RGD-4C基因和增强细胞免疫调节作用的IL-12-p40基因、IRES基因和IL-12-p35基因有效连接到腺病毒表达载体上，和将腺病毒载体上的CMV启动子置换成肝癌启动子AFP启动子，从而构建成溶瘤病毒表达载体Adv-AdeAFP+RGD-4C+p40-IRES-p35。


9.一种构建权利要求1-5中任一项的病毒构建体方法，其特征在于，包括以下步骤：
任选地(1)构建Ade-PDC316-CMV-GFP质粒：设计含有HindⅢ-GFP正向扩增引物，和SalⅠ-GFP反向扩增引物,从PSMPUW-GFP扩增带有HindⅢ/SalⅠ双酶切位点的GFP目的基因，同时使用HindⅢ/SalⅠ双酶切Ade-PDC316-CMV载体，连接获得质粒Ade-PDC316-CMV-GFP；
(2)构建Ade-PDC316-CMV-IRES质粒：设计含有EcoRⅠ-IRES-F的正向扩增引物和HindⅢ-IRES-R的反向扩增引物，自PSMPUW-IRES-GFP扩增引入带有EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点的IRES基因片段，并使用EcoRⅠ/HindⅢ酶切IRES基因片段和Ade-PDC316载体，连接后构建质粒Ade-PDC316-CMV-IRES；
(3)构建Ade-PDC316-CMV-IL-12-p40-IRES质粒：设计含有EcoRⅠ-IL-12-p40-F的正向扩增引物和EcoRⅠ-IL-12-p40-R的方向扩增引物，自NK细胞的cDNA扩增含有酶切位点的EcoRⅠ的IL-12-p40目的基因，然后分别使用EcoRⅠ单酶切EcoRⅠ的IL-12-p40目的基因和Ade-PDC316-CMV-IRES载体，连接验证顺序后构建质粒Ade-PDC316-CMV-IL-12-p40-IRES；
(4)构建Ade-PDC316-CMV-IL-12-p40-IRES-IL-12-p35质粒：设计含有HindⅢ-IL-12-p35-F的正向扩增引物和HindⅢ-IL-12-p35-R的反向扩增引物，自NK细胞的cDNA扩增含有酶切位点的HindⅢ的IL-12-p35目的基因，然后分别使用HindⅢ单酶切IL-12-p35目的基因和Ade-PDC316-CMV-IL-12-p40-IRES载体，连接验证顺序后构建质粒Ade-PDC316-CMV-IL-12-p40-IRES-IL-12-p35；
任选地(5)构建Ade-PDC316-CMV-IL-12-p40-IRES-IL-12-p35-GFP质粒：使用EcoRⅠ/HindⅢ酶切Ade-PDC316-CMV-IL-12-p40-IRES-IL-12-p35和Ade-PDC316-CMV-GFP载体，连接后构建质粒Ade-PDC316-CMV-IL-12-p40...

【专利技术属性】
技术研发人员：宫晓艳，周海涛，秦苗苗，刘进稳，
申请(专利权)人：药鼎北京国际细胞医学技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11