外周血不成熟DC细胞外泌体制备方法技术

本发明专利技术涉及一种外周血不成熟DC细胞外泌体制备方法，包括：1)将从外周血中分离得到的PBMC细胞使用培养基A培养，得到离体不成熟树突状细胞；2)将所述离体未成熟树突状细胞在培养基B中培养后，将培养液低温离心以去除死细胞和碎片，过滤去除囊泡；得到的液体进行超速离心，弃上清，得到不成熟DC细胞外泌体；其中，所述培养基A在AIM‑V培养基的基础上额外添加了自体血浆、GM‑CSF、IL‑4以及PEG‑2；所述培养基B在AIM‑V培养基的基础上额外添加了无外泌体自体血浆、GM‑CSF、IL‑4、TGF‑β、VEGF。该方法不仅能够有效抑制DC成熟，还具有较高的外泌体收率。

Preparation of immature DC cell exosome from peripheral blood

The invention relates to a preparation method of immature DC cell exosome from peripheral blood, which includes: 1) PBMC cells isolated from peripheral blood are cultured in culture medium A to obtain immature dendritic cells in vitro; 2) After culturing the immature dendritic cells in culture medium B, the culture medium is centrifuged at low temperature to remove dead cells and debris, and the obtained liquid is filtered to remove vesicles; Immature DC cell exosomes were obtained by ultracentrifugation and discarding supernatant, in which autologous plasma, GM_CSF, IL_4 and PEG_2 were added on the basis of AIM_V medium, and autologous plasma, GM_CSF, IL_4, TGF_beta and VEGF were added on the basis of AIM_V medium. This method not only can effectively inhibit DC maturation, but also has high exosome yield.

【技术实现步骤摘要】
外周血不成熟DC细胞外泌体制备方法
本专利技术涉及外泌体分离
，具体而言，涉及一种外周血不成熟DC细胞外泌体制备方法。
技术介绍
树突状细胞(Dendriticcells，DCs)是体内最有效的抗原提呈细胞，表面表达B7、MHC-Ⅱ类分子、ICAM-1等多种共刺激分子，激活辅助T细胞，促使其分泌IL-2等细胞因子，传递特异性抗原信号，最终活化细胞毒性T细胞，因此DC细胞在体内起到启动一系列免疫反应的关键作用，在机体的免疫功能以及肿瘤的免疫治理中有重要意义。大多数DC细胞来源于骨髓，由骨髓进入外周血，再分布到全身各组织中，DC广泛分布于除脑以外的全身各脏器，但数量极少，仅占外周血单个核细胞的1％以下。DC前体细胞随血液分布到肠道、心、肝等各非淋巴器官后，发育为不成熟DC细胞。此时，DC细胞具有较强的抗原摄取加工能力，而激活T细胞的能力低下。不成熟DC通常指的是未被外来抗原或者外界环境中的炎症因子所刺激的DC，它具有强大的胞吞功能，即通过巨胞饮吞噬水溶性的抗原，受体介导的内吞作用摄取蛋白质和抗原-抗体免疫复合物，或者直接吞唾消化整个细胞。它表面低表达MHCII，CD80，CD86等分子。外泌体(exosomes)，是一种脂质分子膜包裹的小囊泡。电镜下观察呈杯状，直径约为40-100nm，密度约为1.13-1.19g/mL。外泌体含有来源细胞的胞质和脂质包膜成分，外泌体内部包含有丰富的mRNA，microRNA和蛋白质成分。外泌体形成是通过多囊泡胞内体(MVE)的细胞区室向内出芽的形式形成，内囊泡内含有蛋白质、microRNA及mRNA。当MVE与细胞膜融合时，内囊泡就被释放到细胞外成为外泌体，释放出来的外泌体能够运行到距离较远的组织而影响细胞的行为和生理上的改变。正常状态下，免疫系统维持稳态，即对自身抗原耐受，而对外来抗原启动免疫应答，以清除外来抗原。DC的成熟状态在免疫系统维持稳态的这一过程中起着非常重要的作用。成熟DC表面高表达MHCII、CD80、CD86等分子，能够刺激初始T淋巴细胞对外来抗原进行应答，进而消灭外来抗原。而不成熟DC提呈自身抗原，诱导T淋巴细胞免疫耐受，从而避免免疫系统对自身组织的攻击。因而，不成熟DC细胞的外泌体在多种自身免疫性疾病方面有广阔的应用前景，然而现有技术中缺乏一种完善的不成熟DC细胞的外泌体的制备方法。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种外周血不成熟DC细胞外泌体制备方法，该方法制备得到的不成熟DC细胞外泌体高效、成本低、纯度高。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：本专利技术涉及一种外周血不成熟DC细胞外泌体制备方法，包括：1)将从外周血中分离得到的PBMC细胞使用培养基A培养，得到离体不成熟树突状细胞；2)将所述离体未成熟树突状细胞在培养基B中培养后，将培养液低温离心以去除死细胞和碎片，过滤去除囊泡；得到的液体进行超速离心，弃上清，得到不成熟DC细胞外泌体；其中，所述培养基A为额外添加包括下列成分的AIM-V培养基：0.8～1.2v/v％自体血浆、GM-CSF40～60ng/mL、IL-410～30ng/mL以及PEG-20.4～0.6μg/mL；所述培养基B为额外添加包括下列成分的AIM-V培养基：0.8～1.2v/v％无外泌体自体血浆、GM-CSF30～50ng/mL、IL-430～50ng/mL、TGF-β10～20ng/mL、VEGF40～50ng/mL。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：(1)本专利技术提供的外周血不成熟DC细胞外泌体制备方法的制备方法，方法简便易行，分离得到的外周血不成熟DC细胞外泌体稳定可靠。(2)通过优选的培养基配方，不仅能够提高不成熟树突状细胞的比例，还能获得更好的外泌体收率。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术一个实施例中制备得到DC细胞的流式图。具体实施方式为了促进理解本文描述的实施方式这一目的，将参考某些实施方式，并且将使用特定语言来描述这些实施方式。本文所使用的术语仅用于描述具体实施方式目的，而不旨在限制本公开的范围。具体的，本专利技术涉及一种外周血不成熟DC细胞外泌体制备方法，包括：1)将从外周血中分离得到的PBMC细胞使用培养基A培养，得到离体不成熟树突状细胞；2)将所述离体未成熟树突状细胞在培养基B中培养后，将培养液低温离心以去除死细胞和碎片，过滤去除囊泡；得到的液体进行超速离心，弃上清，得到不成熟DC细胞外泌体；其中，所述培养基A为额外添加包括下列成分的AIM-V培养基：0.8～1.2v/v％自体血浆、GM-CSF40～60ng/mL、IL-410～30ng/mL以及PEG-20.4～0.6μg/mL；所述培养基B为额外添加包括下列成分的AIM-V培养基：0.8～1.2v/v％无外泌体自体血浆、GM-CSF30～50ng/mL、IL-430～50ng/m、TGF-β10～20ng/mL、VEGF40～50ng/mL。在一些实施方式中，所述培养基A为额外添加包括下列成分的AIM-V培养基：0.9～1.1v/v％自体血浆、GM-CSF45～55ng/mL、IL-415～25ng/mL以及PEG-20.45～0.55μg/mL。在一些实施方式中，所述培养基A为额外添加包括下列成分的AIM-V培养基：1.0v/v％自体血浆、GM-CSF50ng/mL、IL-450ng/mL以及PEG-20.5μg/mL。在一些实施方式中，所述培养基B为额外添加包括下列成分的AIM-V培养基：0.9～1.1v/v％无外泌体自体血浆、GM-CSF35～45ng/mL、IL-435～45ng/mL、TGF-β13～17ng/mL、VEGF43～47ng/mL。在一些实施方式中，所述培养基B为额外添加包括下列成分的AIM-V培养基：1.0v/v％无外泌体自体血浆、GM-CSF40ng/mL、IL-440ng/mL、TGF-β15ng/mL、VEGF45ng/mL。在一些实施方式中，所述方法涉及到的细胞培养条件均在35至40℃之间和在1至10％的CO2之间，优选为36至38℃之间和在4至6％的CO2之间。在一些实施方式中，在使用培养基A培养之前还包括贴壁培养，在所述贴壁培养中，PBMC细胞的接种密度为4～6×107/20ml。在一些实施方式中，PBMC细胞的接种密度还可以选择为5×107/20ml/50ml。在一些实施方式中，以所述贴壁培养所用培养瓶的可用的细胞培养面积175cm2计，所述贴壁培养所用的培养基的添加量为15～25ml，还可以选择20ml。在一些实施方式中，所述贴壁培养所用的培养基为包含0.8～1.2％自体血浆的AIM-V培养基。在一些实施方式中，所述贴壁培养所用的培养基为包含1.0v/v％自体血浆的AIM-V培养基。在一些实施方式中，以步骤1)培养所用培养瓶的可用的细胞培养面积175cm2计，步骤1)培养所用的培养基的添加量为25～35ml，还可以选本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种外周血不成熟DC细胞外泌体制备方法，其特征在于，包括：1)将从外周血中分离得到的PBMC细胞使用培养基A培养，得到离体不成熟树突状细胞；2)将所述离体未成熟树突状细胞在培养基B中培养后，将培养液低温离心以去除死细胞和碎片，过滤去除囊泡；得到的液体进行超速离心，弃上清，得到不成熟DC细胞外泌体；其中，所述培养基A为额外添加包括下列成分的AIM‑V培养基：0.8～1.2v/v％自体血浆、GM‑CSF 40～60ng/mL、IL‑4 10～30ng/mL以及PEG‑2 0.4～0.6μg/mL；所述培养基B为额外添加包括下列成分的AIM‑V培养基：0.8～1.2v/v％无外泌体自体血浆、GM‑CSF 30～50ng/mL、IL‑4 30～50ng/mL、TGF‑β10～20ng/mL、VEGF 40～50ng/mL。

【技术特征摘要】
1.一种外周血不成熟DC细胞外泌体制备方法，其特征在于，包括：1)将从外周血中分离得到的PBMC细胞使用培养基A培养，得到离体不成熟树突状细胞；2)将所述离体未成熟树突状细胞在培养基B中培养后，将培养液低温离心以去除死细胞和碎片，过滤去除囊泡；得到的液体进行超速离心，弃上清，得到不成熟DC细胞外泌体；其中，所述培养基A为额外添加包括下列成分的AIM-V培养基：0.8～1.2v/v％自体血浆、GM-CSF40～60ng/mL、IL-410～30ng/mL以及PEG-20.4～0.6μg/mL；所述培养基B为额外添加包括下列成分的AIM-V培养基：0.8～1.2v/v％无外泌体自体血浆、GM-CSF30～50ng/mL、IL-430～50ng/mL、TGF-β10～20ng/mL、VEGF40～50ng/mL。2.根据权利要求1所述的外周血不成熟DC细胞外泌体制备方法，其特征在于，在使用培养基A培养之前还包括贴壁培养，在所述贴壁培养中，PBMC细胞的接种密度为4～6×107/20ml。3.根据权利要求2所述的外周血不成熟DC细胞外泌体制备方法，其特征在于，所述贴壁培养所用的培养基为包含0.8～1.2％自体血浆的AIM-V培养基。4.根据权利要求1～3任一项所述的外周血不成熟DC细胞外泌体制备方法，其特征在于，步骤1)的培养时间为4d～6d；优选的，在培养的第2d～4d时，补加所述培养基A。5.根据权利要求4所述的外周血不成熟DC细胞外泌体制备方法，其特征在于，在将所述离体未成熟树突状细胞从培养基A转移到培养基B中时，将培养基A中的...

【专利技术属性】
技术研发人员：周海涛，
申请(专利权)人：药鼎北京国际细胞医学技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11