精神分裂症外周血标志物miR‑132及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种外周血microRNA分子标志物及其在精神分裂症诊断和预后检测的应用，该标志物为has‑miR‑132。我们研究表明miR‑132在精神分裂症患者外周血单个核细胞中的表达量低于正常人，miR‑132可以作为具有精神分裂症诊断和预后检测的一种生物标志物。本发明专利技术还提供了一种外周血miR‑132的检测方法，通过测定患者外周血miR‑132含量可以快速、准确的对精神分裂症作出诊断和预后疗效的鉴定，具有准确性高、方法简捷、成本低等优点。

【技术实现步骤摘要】
精神分裂症外周血标志物miR-132及其应用
本专利技术属于生物技术和医学领域，涉及一种血液样本microRNA分子标志物miR-132及其应用，更具体地，本专利技术涉及一种血液microRNA分子标志物miR-132及其在精神分裂症临床诊断和预后检测方面的应用能力。
技术介绍
精神分裂症(Schizophrenia)是一组病因未明的复杂精神疾病，多发生于青壮年，临床表现为感知、思维、情感、行为等多方面的障碍以及精神活动的不协调，流行病学调查显示在世界成年人口中的终身患病率为1％左右。据估算我国目前有700-800万精神分裂症患者，由此每年所造成的医疗费用支出、患者本人及家属的生产力损失是十分惊人的。目前的研究证明精神分裂症属于多基因复杂性遗传性疾病。研究证明众多microRNAs(miRNAs)参与了精神分裂症的整个过程，在精神分裂症的诊断、发病机理、治疗等方面扮演重要的角色。miRNAs是一类短的内源性非编码单链RNA分子，它们在转录后水平调节基因的表达，进而影响一系列的生物过程和疾病。miRNAs是许多基因表达的调节者和神经发育的关键调节因素。在神经系统中，miRNAs参与到脑发育、神经元分化、突触可塑性，以及几乎所有的精神和神经病学的症状，如精神分裂症、自闭症、脆性X染色体综合症、Rett综合症等。不断累积的研究成果也已充分证实miRNA的异常表达与精神分裂症的发生、发展密切相关。血液是医学诊断中最常用的生物检测样本，血液具有取材方便，无创伤性，并可连续体外检测的优点。由于血液中miRNA特殊的稳定性和检测的简便可行，近年来血液miRNAs相关的研究已经逐渐获得科学家的认可。因此使基于miRNA定性和定量检测技术寻找精神分裂症特异性的血液miRNA作为分子指标用于精神分裂症的早期筛查、诊断和预后疗效评价具有重要的科研和临床应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种精神分裂症miRNA生物标志物miR-132(miRBase登录号：MIMAT0000426)能作为精神分裂症生物标志物及其在精神分裂症早期诊断和预后疗效评价中的新用途。在前期的研究工作中，专利技术人首先通过miRNA芯片检测精神分裂症患者与正常人血液样品中存在的差异表达miRNAs。通过进一步对大样本量样品的Real-timePCR和Northern实验验证并确定精神分裂症患者血液中miRNA-132表达明显比正常人血样中的表达量低。研究说明miR-132可以作为精神分裂症发病的特异性生物标志物。本专利技术的有益效果是提供了一种重要的精神分裂症外周血标志物，为临床精神分裂症诊断、用药监测及预后疗效评判提供了客观真实的分子物质，未来可成为医院精神科临床精神分裂症诊断和治疗的关键靶点之一。一、样本收集和前处理从新乡医学院第二附属医院(河南省精神病医院)SCZ血液资源库中筛选入组偏执型SCZ患者300例，健康对照200例。年龄在18-40岁之间，男女比例约为1:1，并严格按照年龄、性别、民族等配对原则。本研究已通过新乡医学院第二附属医院医学伦理委员会审查，临床试验方案合乎道德原则。病例组和对照组均经过正式书面告知。SCZ组纳入标准：患者诊断由两名主治医师以上，且已经过DSM-IV定式检查工具SCID-IP(StructuredClinicalInterviewforDSM-IVaxisIdisorders，researchversionforpatients)对患者进行系统精神检查，符合偏执型SCZ的诊断标准，并同时评定阴性阳性症状量表(PositiveandNegativeSyndromeScale,PNASS)评分＞60分；近期未用过任何抗精神病药物；年龄在18-40岁之间；治疗前抽取外周血液标本。血液样本前处理：血液样品使用淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque获得单个核细胞；对上述外周血样品提取总RNA；以总RNA为模板将miR-132特异性转录为cDNA。二、miRNAs芯片杂交和数据分析正常人和精神分裂症病人血液样品分别以20例样本总RNA等量混合(pool)，SCZ组为6个pool(120例病例血样)，对照组为6个pool(120例病例血样)，每个pool重复3次，使用Agilent公司的含有1887个miRNAs的高密度miRNAs芯片，对每个pool进行miRNAs表达量检测。三、使用Real-timePCR和NorthernBlot方法验证miRNAs芯片结果从miRNAs芯片结果中选取差异miRNAs对所有采集的血液样品，使用Real-timePCR方法验证，并使用NorthernBlot对Real-timePCR阳性结果进行进一步的确证，经过SPSS软件系统的统计分析，找出SCZ中显著差异表达的miRNAs。四、对大量正常人血液RNA样本进行miR-132表达的绝对定量以U6snRNA为内参基因，使用miR-132特异引物进行Real-timePCR扩增，对正常人血液标本进行了绝对定量。五、本专利技术的外周血miR-132的检测方法：1、采集待测人员的外周血样品，分离外周血单个核细胞并提取总RNA；2、以总RNA为模板将miR-132特异性转录为cDNA；3、以U6snRNA为内参基因，使用miR-132特异引物进行Real-timePCR扩增，对待测人员样品中miRNA-132含量进行定量。这里引入Ct值概念，即每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。△CT值为miR-132与U6snRNA的CT值的差，当△CT≥8.23时为miR-132表达阳性。六、本专利技术的试剂盒包括1、血液抽提系统包括EDTA抗凝、Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液；2、总RNA提取系统：Trizol、氯仿、异丙醇、RNA-free水；反转录系统：10×Buffer、dNTP、RNA抑制剂、逆转录酶、miR-132特异逆转录引物；3、Real-timePCR系统：2×SYBRmix、ROXⅡ、ddH2O、miR-132特异性Real-timePCR引物。所述引物系统主要包括has-miR-132逆转录颈环引物、has-miR-132正反向检测引物和U6内参基因正反向引物:Has-miR-132的逆转录引物是:5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGACCAT-3’(SEQNO1)；Has-miR-132的正向引物是:5’-GCCGTAACAGTCTACAGCCA-3’(SEQNO2)；Has-miR-132的反向引物是:5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3’(SEQNO3)；U6snRNA的逆转录引物是:5’-AAAATATGGAACGCTTCACGAATTTG-3’(SEQNO4)；U6的正向引物是:5’-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3’(SEQNO5)；U6的反向引物是:5’-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3’(SEQNO6)；本专利技术的方法可以检测各种人群外周血中miR-132的表达情况，用于精神分裂症的前期诊断和预本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种血液microRNA分子标志物，其特征在于：所述血液microRNA分子标志物是has‑miR‑132，miR‑132成熟序列为： UAACAGUCUACAGCCAUGGUCG。

【技术特征摘要】
1.一种外周血miR-132检测试剂盒，其特征在于，试剂盒包括：血液抽提系统、总RNA提取系统、反转录系统、Real-timePCR系统；所述血液抽提系统包括：EDTA抗凝、Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液；所述总RNA提取系统包括：Trizol、氯仿、异丙醇、RNA-free水；所述反转录系统包括：10×Buffer、dNTP、RNA抑制剂、逆转录酶、miR-132特异逆转录引物；所述Real-timePCR系统包括：2×SYBRmix、ROXⅡ、ddH2O、miR-132特异性Real-timePCR引物；所述引物包括：has-miR-132逆转录颈环引物、has-miR-132正反向检测引物和U6内参基因正反向引物；Has-miR-132的逆转录引物是:5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGACCAT-3’；Has-miR-132的正向引物是:5’-GCCGTAACAGTCTACAGCCA-3’...

【专利技术属性】
技术研发人员：于海川，吴娇，吕路线，张红星，李超堃，翟鹏飞，郭素芹，
申请(专利权)人：新乡医学院，
类型：发明
国别省市：河南;41