本发明专利技术涉及血管细胞分离技术领域,特别涉及一种从外周血中分离富集血管内皮祖细胞的方法：获取外周血样，用PBS磷酸缓冲液稀释；在羟乙基淀粉溶液中加入稀释的血液，离心,吸取中间白膜细胞层的单个核细胞液；用PBS磷酸缓冲液稀释，离心弃上清,剩余物用培养液重悬；培养传代。分离效率高，杂细胞少，仅需少量的实验器材；分离效果好，具有可重复性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及血管细胞分离
,特别涉及一种从外周血中分离富集血管内皮祖细胞的方法。
技术介绍
EPC(endothelialprogenitorcells，血管内皮祖细胞)是一类能循环、增殖并分化为血管内皮细胞，但尚未表达成熟血管内皮细胞表型，也未形成血管的前体细胞。该细胞体外培养的生理形态为鹅卵石样内皮细胞层，EPC鉴定的通用表面标记为：CD45(-)、CD34(+)、KDR(+)、CD31(+)。在来源于外周血的EPC细胞群被鉴定和描述后，在成体中的血管生成也开始被报道出来。大量的文献报道都在着重强调EPC维持血管内皮完整性的重要性。其中EPC通过发挥旁分泌效应促进血管生成和自身整合到新血管组织这两条途径来维持内皮的完整性。EPC的血液循环数与心血管危险因子存在着一个反比关系。EPC在众多血管性疾病(血管创伤、脑卒中、心血管疾病，糖尿病并发症等)的血管修复中起着重要的作用，同时EPC可用作产生组织工程血管、人造心脏瓣膜以及癌症的治疗、基因治疗的载体。随着科研人员对EPC(血管内皮祖细胞)在众多血管性疾病(血管创伤、脑卒中、心血管疾病，糖尿病并发症等)的血管修复中起着重要作用的认识不断加深，如何获取快速获取EPC成为了EPC基础研究和临床研究中首要解决问题。从外周血中分离富集EPC的研究是一个研究EPC生物学特性、血管重建和血管生成非常好的工具，同时对于研究EPC在成体中血管修复的机理是具有非常重要的临床应用价值。现阶段中分离和富集EPC的步骤在不同文献报道中各不相同，分离效率、增殖潜能等多个重要指标存在很大差异，且缺乏一个有效可比性的结果。较为通用分离富集方法为：采集人新鲜外周血，从人体外周血中分离单个核细胞，再利用大致适合于EPC生长的的培养基培养；根据细胞形态挑选EPC样的单个克隆，再利用表面标志物鉴定流式细胞分选、RT-PCR分析、内皮细胞摄取Ac-LDL功能分析所得细胞是否为EPC。但不同课题组、不同文献报道(或申请专利)的分离培养方案、培养基成分差异较大，所宣称的效果(细胞增殖潜能等)亦差异巨大。现阶段中由于分离和富集EPC的步骤在各团队中各不相同，且缺乏一个有效可比性的结果。同时，由于各种分离培养条件选择的不同，包括血液的体积、处理时间、血液抗凝剂、涂层机制和胎牛血清的比例等因素均会影响到分离富集的细胞的种类和数量。在对于EPC的基础研究和临床研究当中，均没有一个统一的可以结果之间进行相互比较的分离富集方法。同时，市场上得到广泛应用的EPC培养基EBM-2实际上是针对脐带血内皮祖细胞(HUVEC)的分离培养而研制的，目前尚缺乏成熟可靠的成年人外周血内皮祖细胞专用培养基。
技术实现思路
为了解决以上现有技术在EPC分离中存在的分离效率、增殖潜能差别大的问题,本专利技术旨在建立一个标准、通用、高效的从外周血中分离富集血管内皮祖细胞的方法，通过实验摸索出的分离过程中的最优的条件，使得分离结果的各个指标之间具有可比性，解决分离细胞结果不稳定的问题，提高分离富集细胞得率，用于EPC的细胞生理特性的基础研究和血管修复、再生的临床应用。本专利技术是通过以下措施实现的：一种从外周血中分离富集血管内皮祖细胞的方法,包括以下步骤：(1)获取待分离富集的外周血样(2小时内进行处理)，在离心管中颠倒混匀一次，用pH7.2的PBS磷酸缓冲液1:1稀释得到稀释的血液，稀释时先向管中加入PBS磷酸缓冲液，再加入外周血样；(2)取4个50mL离心管，每个加质量/体积百分比浓度为3.5-5.0％的羟乙基淀粉溶液15mL，在羟乙基淀粉溶液中缓慢加入20mL稀释的血液，确保稀释的血液留在羟乙基淀粉溶液上层，室温375-425r/min，离心30-35min,结束后吸取中间白膜细胞层的单个核细胞液，约20mL，每两管的吸取物合并为一管；(3)取2个新管，每管加入15-20mL步骤(2)中得到的吸取物，分别用pH7.2的PBS磷酸缓冲液1:1稀释，室温275-325r/min，离心15-20min,弃上清,剩余物用1mL培养液重悬,培养液组成为每80mLEBM-2基础培养基中加入FGF20.1-0.2mL、VEGF0.1-0.2mL、IGF-10.1-0.2mL、BMP-40.1-0.2mL、LiF0.3-0.5mL和GA0.1-0.2mL；(4)将8mL培养液加入其中一管，混匀后加入另一管，共10mL悬液；(5)取10μL加入到490μLDPBS中，混匀，从中取10μL计数，其中视野之内的4个大格总数之和为N，总细胞数＝104×50×10×N/4，其中N为视野内细胞总数,N≥35,总细胞数≥4.375×107；(6)胶原蛋白酶I铺细胞培养瓶：50μg/mL的胶原蛋白酶I105μL溶于0.02M的醋酸7.5mL，0.22μm过滤器过滤，铺于T75瓶，37℃1小时，室温1小时，10mLDPBS冲洗2次，加5mL培养液；将步骤(4)得到的10mL悬液注入，48h后半换液一次，操作为抽出7.5mL原培养液，新加入7.5mL培养液，此后每72h半换液一次，培养条件CO2培养箱中37℃、CO2浓度5％培养，前12天不可观察细胞；(7)传代：细胞增殖至细胞密度为90-100％时，传至3个培养瓶，继续培养。所述的方法，优选传代10-15代。所述的方法，优选步骤(2)中离心速度为390-410r/min。所述的方法，优选步骤(3)中离心速度为280-300r/min。所述的方法，优选步骤(2)中离心速度为380r/min，离心30min。所述的方法，优选步骤(3)中离心速度为280r/min，离心20min。刚分离出来时绝大多数细胞为杂细胞(EPC只占1/106左右)，而EPC细胞在最初2-4周无法通过外形观察分别出(亦不便于用其他技术手段直接检测浓度)。分离培养2-4周后，EPC细胞才开始出现具有典型特征的细胞外形并可观察到分裂增殖集落(“集落”大意为一个细胞分裂多次后产生的细胞群)，增殖集落长到约1乘以105个细胞时需传至另一培养瓶以使细胞分布得较为分散(培养条件同前---胶原蛋白酶I铺细胞培养瓶，15ml培养液，CO2培养箱中37℃、CO2浓度5％培养)。从分离首日起计算，传代、培养至总第100天可持续增殖，不会分化为终末状态的内皮细胞，亦不会观察到明显的的细胞凋亡、坏死。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术把分离富集人外周血内皮祖细胞的程序进行了标准化；(2)在操作过程中，使用者可以方便快捷的进行分离，仅需提供本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种从外周血中分离富集血管内皮祖细胞的方法,其特征在于包括以下步骤：（1）获取待分离富集的外周血样，在离心管中颠倒混匀一次，用pH 7.2的PBS磷酸缓冲液1:1稀释得到稀释的血液，稀释时先向管中加入PBS磷酸缓冲液，再加入外周血样；（2）取4个50mL离心管，每个加质量/体积百分比浓度为3.5‑5.0 %的羟乙基淀粉溶液15mL，在羟乙基淀粉溶液中缓慢加入20mL稀释的血液，确保稀释的血液留在羟乙基淀粉溶液上层，室温375‑425r/min，离心30‑35min, 结束后吸取中间白膜细胞层的单个核细胞液，每两管的吸取物合并为一管；（3）取2个新管，每管加入15‑20mL步骤(2)中得到的吸取物，分别用pH 7.2的PBS磷酸缓冲液1:1稀释，室温275‑325r/min，离心15‑20min,弃上清,剩余物用1mL培养液重悬, 培养液组成为每80mL EBM‑2基础培养基中加入FGF2 0.1‑0.2mL、VEGF 0.1‑0.2mL、IGF‑1 0.1‑0.2mL、BMP‑4 0.1‑0.2mL、LiF 0.3‑0.5 mL和GA 0.1‑0.2mL；（4）将8mL培养液加入其中一管，混匀后加入另一管，共10mL悬液；（5）计数；（6）胶原蛋白酶I铺细胞培养瓶： 50μg/mL的胶原蛋白酶I 105μL溶于0.02M的醋酸7.5mL，0.22μm过滤器过滤，铺于T75瓶，37℃1小时，室温1小时，10mLDPBS冲洗2次，加5mL培养液；将步骤（4）得到的10mL悬液注入，48h后半换液一次，操作为抽出7.5mL原培养液，新加入7.5mL培养液，此后每72h半换液一次，培养条件 CO2培养箱中37℃、CO2浓度5%；（7）传代：细胞增殖至细胞密度为90‑100%时，传至3个培养瓶。...
【技术特征摘要】
1.一种从外周血中分离富集血管内皮祖细胞的方法,其特征在于包括以下步骤：
（1）获取待分离富集的外周血样，在离心管中颠倒混匀一次，用pH7.2的PBS磷酸缓冲液1:1稀释得到稀释的血液，稀释时先向管中加入PBS磷酸缓冲液，再加入外周血样；
（2）取4个50mL离心管，每个加质量/体积百分比浓度为3.5-5.0%的羟乙基淀粉溶液15mL，在羟乙基淀粉溶液中缓慢加入20mL稀释的血液，确保稀释的血液留在羟乙基淀粉溶液上层，室温375-425r/min，离心30-35min,结束后吸取中间白膜细胞层的单个核细胞液，每两管的吸取物合并为一管；
（3）取2个新管，每管加入15-20mL步骤(2)中得到的吸取物，分别用pH7.2的PBS磷酸缓冲液1:1稀释，室温275-325r/min，离心15-20min,弃上清,剩余物用1mL培养液重悬,培养液组成为每80mLEBM-2基础培养基中加入FGF20.1-0.2mL、VEGF0.1-0.2mL、IGF-10.1-0.2mL、BMP-40.1-0.2mL、LiF0.3-0.5mL和GA0.1-0.2mL；
（4）将8mL培养液加入其中一管，混匀后加入另一管，共10mL悬液；
（5）计数；
（6）胶原蛋白酶I铺细胞培养瓶：50μg/mL的胶原蛋白酶I105μL溶于0.02M的醋酸7.5mL，...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩发彬，
申请(专利权)人：山东美加赛培生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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