PF-127-miRNA-615 agomir复合物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物医药技术领域，具体涉及一种PF‑127‑miRNA‑615 agomir复合物及其制备方法和应用，其中PF‑127‑miRNA‑615 agomir复合物是由Pluronic F‑127水凝胶包裹miRNA‑615 agomir而成。本发明专利技术提供了可负载miRNA‑615 agomir并能填充损伤裂隙的运载体，实现miRNA‑615 agomir的精确递送和局部缓释并能够为神经轴突的生长提供三维空间和力学支撑性能。因此，该PF‑127‑miRNA‑615 agomir复合物能够有力促进臂丛神经根性撕脱的神经再生修复，为中枢和外周神经损伤提供治疗新途径。

PF 127 miRNA 615 agomir compound and preparation method and application thereof

The present invention relates to the technical field of biological medicine, in particular to a PF 127 miRNA 615 agomir compound and preparation method and application thereof, wherein PF 127 miRNA 615 agomir complexes by Pluronic F 127 hydrogel coated miRNA 615 agomir. The invention provides a load of miRNA 615 agomir and filling fracture damage of carrier, miRNA 615 agomir accurate delivery and local delivery and can provide a three-dimensional and mechanical supporting performance as the axon growth. Therefore, the PF 127 miRNA 615 agomir complexes can promote the brachial plexus root avulsion of the regeneration and repair of nerve injury, to provide new avenues for the treatment of central and peripheral nerve.

【技术实现步骤摘要】
PF-127-miRNA-615agomir复合物及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种PF-127-miRNA-615agomir复合物及其制备方法和应用。
技术介绍
臂丛神经撕脱(BrachialPlexusAvulsion,BPA)是一种常见的致残性外科创伤，尤其是全臂丛神经根性撕脱，致残率高、疗效不佳、预后差。随着家庭机动车辆和现代交通物流的不断发展，臂丛损伤的发病率逐年增加，其最常见的病因为交通意外和新生儿难产所造成的牵拉性损伤。神经根由中枢部分和外周部分组成，二者的交界部分称为“过渡区”(transitionalzone,TZ)。臂丛撕脱是神经根与脊髓在TZ区发生的物理性断离，不仅引起外周神经断裂，还导致相应脊髓节段神经元严重损伤和大量死亡，神经轴突断裂、突触结构破坏、神经网络中断等，造成受损神经对应皮节的感觉丧失及所支配上肢肌肉瘫痪。为了恢复神经通路和运动功能，受损神经元必须存活和再生轴突，并外向延伸穿过TZ瘢痕，重新进入外周神经干并与所支配肌肉重建突触联系。虽然通过神经外科再植术能使部分运动神经元存活并获得一定的轴突再生，但由于局部病理微环境的抑制作用，胶质瘢痕形成，以及轴突再生能力极其有限等原因，神经再生和运动功能恢复的效果并不令人满意。因此，臂丛神经根性撕脱治疗的关键问题在于如何改善损伤局部的抑制性病理微环境，有效促进神经轴突的再生修复与外向延伸，以恢复过渡区神经联系的延续性，重建突触联系，改善肢体的运动功能。相关研究发现，髓磷脂相关抑制因子是脊髓损伤后局部微环境中的重要抑制因素。该类抑制因子由髓鞘和胶质瘢痕合成释放，主要包括轴突生长抑制因子(neuriteoutgrowthinhibitoryA，NogoA)、髓磷脂相关糖蛋白(myelin-associatedglycoprotein,MAG)和少突胶质细胞髓磷脂糖蛋白(oligodendrocytemyelinglycoprotein,OMgp)。这些髓磷脂相关抑制因子可与神经细胞上的共受体成分LINGO-1(LRRandIgdomain-containingNogoreceptorinteractingprotein)结合而介导抑制效应，抑制中枢神经轴突生长和髓鞘形成。LINGO-1在脑和脊髓的神经元及少突胶质细胞上选择性表达，参与细胞膜上NgR1/p75/LLNGO-1或NgR1/Troy/LINGO-1信号转导复合物的构成。LINGO-1与抑制因子结合使信号复合物活化，通过RhoA激酶的作用将下游抑制信号转导入神经元和少突胶质细胞，从而阻碍神经轴突的再生修复与髓鞘的形成。研究表明，拮抗LINGO-1对脊髓损伤后的神经再生和功能恢复有明显促进作用。同时，我们的前期研究发现，用慢病毒Lingo-1RNAi干扰LINGO-1的表达，可影响移植性神经干细胞的发育分化，并能促进脊髓全横断大鼠的神经再生和运动功能恢复。但关于其发挥作用的胞内机制，目前尚未可知。近年来，miRNA因其功能多样化而在组织工程学领域中的备受关注。miRNA是通过调控靶基因而影响表观遗传的重要分子，主要通过种子序列(seedsequence)与靶mRNA3’-端非翻译区(3’-untranslatedregion,3’-UTR)部分或完全互补结合而抑制基因表达或介导靶基因降解，实现转录后水平的广泛基因调控。miRNA介导的基因沉默效应涉及真核生物细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡、免疫调节等各种发育和代谢过程。因此，我们推测，miRNA是否也参与LINGO-1基因表达的生物调控过程。通过生物信息学在线软件预测和功能分析，我们初步筛选出可能对LINGO-1基因具有潜在调控作用的miRNA，再经细胞转染后双荧光素酶报告系统和westernblotting验证，证实miRNA-615对LINGO-1的表达有负调控作用。由于miRNA动物实验的体内环境复杂，实验周期长，对miRNA的稳定性要求更高，而人工合成的miRNA-615的拟似物(miRNA-615mimics)具有较好的分子稳定性和miRNA活性，所以，需要选择合适的miRNA-615拟似物；另一方面，如何准确地将miRNA-615拟似物运输到损伤局部以有效地发挥其基因调控作用成为难题。因此，亟待有可负载miRNA-615拟似物并能填充损伤裂隙的运载体，该运载体应具备高效、无毒、较好的生物相容性、生物降解性等特点，同时还应为神经轴突外向延伸生长提供必要的条件支持。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种所述能负载miRNA-615agomir、并能促进臂丛撕脱神经再生修复的水凝胶包裹miRNA-615agomir复合物及其制备方法以及该复合物在制备治疗臂丛神经根性撕脱的药物中的应用。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：提供PF-127-miRNA-615agomir复合物，所述复合物由以下组份制成：PluronicF-127水凝胶、去离子水和miRNA-615agomir，所述miRNA-615agomir包括SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。优选的，PluronicF-127水凝胶与去离子水的用量比为每100ml去离子水中加入20g～25g的PluronicF-127水凝胶。优选的，miRNA-615agomir在PluronicF-127水凝胶与去离子水充分混合后得到的混合液中的浓度为18～23nmol/ml。优选的，miRNA-615agomir是经特殊化学修饰合成的miRNA-615拟似物，是由广州锐博生物科技有限公司合成的。本专利技术还提供上述PF-127-miRNA-615agomir复合物的制备方法，包括以下步骤：(1)miRNA-615agomir的合成；(2)水凝胶原液的制备：称取一定量的水凝胶，将其与去离子水在无菌条件下配制成混悬液，将混悬液置于一定温度条件下，使水凝胶充分溶解，然后过滤除菌，得水凝胶原液；(3)水凝胶与miRNA-615agomir混合液的制备：在一定温度条件下，将步骤(1)的miRNA-615agomir与步骤(2)制备的水凝胶原液搅拌使其充分混合，得水凝胶与miRNA-615agomir的混合液，备用；(4)水凝胶包裹miRNA-615agomir：取步骤(3)制备的混合液加入至24孔板，使混合液平铺孔底，然后放入培养箱在一定温度下温一段时间后，使孔底形成不透明薄胶状物，即得PF-127-miRNA-615agomir复合物。优选的，所述步骤(1)，miRNA-615agomir是由广州锐博生物科技有限公司合成的。优选的，所述步骤(2)，水凝胶和去离子水在无菌条件下配制成质量体积比浓度为0.20～0.25g/ml的混悬液，将混悬液置于0～4℃，使水凝胶充分溶解，然后采用0.20μm孔径的滤膜除菌，得水凝胶原液。优选的，所述步骤(3)，在0～4℃条件下，以每毫升水凝胶原液中含20nmolmiRNA-615agomir的浓度搅拌使其充分混合，得水凝胶与miRNA-615agomir的混合液。优选的，所述步骤(4)，取步骤(3)制备的混合液，以每孔200μL加至24孔板，使其平铺孔底，然后放置于25℃～37℃培养箱温育3～本文档来自技高网...

【技术保护点】
PF‑127‑miRNA‑615 agomir复合物，其特征在于：所述复合物由以下组份制成：Pluronic F‑127水凝胶、去离子水和miRNA‑615 agomir，所述miRNA‑615 agomir包括SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.PF-127-miRNA-615agomir复合物，其特征在于：所述复合物由以下组份制成：PluronicF-127水凝胶、去离子水和miRNA-615agomir，所述miRNA-615agomir包括SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的PF-127-miRNA-615agomir复合物，其特征在于：PluronicF-127水凝胶与去离子水的用量比为每100ml去离子水中加入20g~25g的PluronicF-127水凝胶。3.根据权利要求1所述的PF-127-miRNA-615agomir复合物，其特征在于：miRNA-615agomir在PluronicF-127水凝胶与去离子水充分混合后得到的混合液中的浓度为18~23nmol/ml。4.根据权利要求1所述的PF-127-miRNA-615agomir复合物，其特征在于：miRNA-615agomir是由广州锐博生物科技有限公司合成的。5.权利要求1至4任意一项所述的PF-127-miRNA-615agomir复合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）miRNA-615agomir的合成；（2）水凝胶原液的制备：称取一定量的水凝胶，将其与去离子水在无菌条件下配制成混悬液，将混悬液置于一定温度条件下，使水凝胶充分溶解，然后过滤除菌，得水凝胶原液；（3）水凝胶与miRNA-615agomir混合液的制备：在一定温度条件下，将步骤（1）的miRNA-615agomir与步骤（2）制备的水凝胶原液搅拌使其充分混合，得水凝胶与miRNA-615agomir的混合液，备用；（4）水凝胶包裹miRNA-615agomir：取步骤（3）制备的混合液加入至24孔板，使混...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴洪福，丁璐，周光纪，曾丽妮，朱哲，刘晓倩，罗传铭，邹堂斌，孙雪荣，邱文锋，张文辉，崔新月，钟家贵，
申请(专利权)人：广东医科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44