用于诱导和扩增源自外周血单个核细胞的自然杀伤细胞的方法技术

本发明专利技术涉及一种诱导和扩增源自外周血单个核细胞的自然杀伤（NK）细胞的方法，其中该方法包括：在存在细胞因子的条件下，将作为饲养细胞的经辐射的Jurkat细胞和经辐射的由EB病毒转化的连续性淋巴细胞株（EBV-LCL）细胞与外周血单个核细胞进行共培养。根据本发明专利技术，可以从少量的外周血单个核细胞中诱导及增殖大量的NK细胞，而无需使用昂贵的设备或各种昂贵的细胞因子，从而可显著提高将所述NK细胞用于癌症时的预防和治疗的效率和效能。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于诱导和扩增源自外周血单个核细胞的自然杀伤细胞的方法
本专利技术涉及一种用于诱导和扩增源自外周血单个核细胞的自然杀伤细胞的方法。
技术介绍
免疫反应能从病原体中保护人体，且免疫系统由众多免疫相关细胞和细胞因子组成。白细胞，尤其淋巴细胞在免疫系统中起重要作用。组成淋巴细胞的代表性细胞包括先天免疫系统细胞和后天免疫系统细胞。自然杀伤细胞（NK细胞）是一种具代表性的先天免疫细胞，已知自然杀伤细胞能以非特异性方式杀伤癌，识别并杀伤病毒、细菌等，而且可以用酶如穿孔素和颗粒酶杀伤病原体，或通过Fas-FasL相互作用杀伤病原体。据报告称，对于癌症患者而言，NK细胞的杀伤癌细胞的能力的降低与肺癌（CarregaP,etal.,Cancer,2008:112:863-875）、肝癌（JinushiM,etal.,JHepatol.,2005:43;1013-1020）、乳癌（BauernhoferT,etal.,EurJImmunol.,2003:33:119-124）、子宫癌（MocchegianiE.,etal.,BrjCancer.,1999:79:244-250）、血癌（TajimaF.,etal,Lekemia1996:10:478-482）等疾病的发病紧密相连。因此，为了癌症治疗，必须要提高癌症患者的自然杀伤细胞的有关杀伤癌细胞的能力及活性。目前，尝试着利用如NK细胞的损伤癌细胞的能力来治疗实体癌（solidcancer）或血癌。为了获得杀伤癌细胞的效果，而需要大量的NK细胞，但难以保证从癌症患者中能够获得大量血液，且血液中的NK细胞的量所占的比例也仅仅约5～20%。由于难以使用NK细胞作为免疫治疗剂，从而重点在于能够有效地扩张并增殖NK细胞。常用于扩增NK细胞的现有方法包括，利用如磁激活细胞分选（magneticactivatedcellsorter，MACS）、cliniMACS或荧光激活细胞分选（fluorescenceactivatedcellsorter，FACS）等装置从骨髓或血液的单个核细胞中分离或诱导出NK细胞。在这种方法中，进行如下操作：1）在早期，从单个核细胞中分离NK细胞，并利用细胞因子对NK细胞进行扩增培养；2）去除与单个核细胞共存的T细胞，并利用细胞因子对NK细胞进行扩增培养；及3）在骨髓中存在的干细胞中诱导NK细胞。此外，根据已有的报告，通过利用饲养细胞从外周血单个核细胞（PBMCs）中分离NK细胞的方法包括，意大利Torelli研究小组的利用源自B细胞白血病的RPMI8866细胞株的方法和日本Ishikawa研究小组的利用源自肾母瘤细胞（Wilmstumorcell）的HFWT细胞株的方法。然而，由于需要精良的设备来选择细胞进行预扩增，并使用基因工程饲养细胞和昂贵的高浓度的各种细胞因子，从而使本领域中有报道的NK细胞的扩增方法受到了阻碍，进而普遍使用来可能过于昂贵，更加难以向病患群体实施该方法，其可用性受到了限制。
技术实现思路
技术问题本专利技术涉及提供一种新型的用于诱导和扩增源自外周血的NK细胞的方法，从而引导出有效的策略，来获得活化的源自外周血的NK细胞，而无需使用昂贵的设备、资源或不受监管所约束。技术方案为了解决这些问题，本专利技术的一方面提供一种有选择地诱导和扩增源自外周血单个核细胞的NK细胞的方法，该方法包括以下的简化方法：在存在细胞因子的条件下，将作为饲养细胞的经辐射的Jurkat细胞和经辐射的EBV-LCL细胞与外周血单个核细胞会以限定的比例及浓度进行共培养。除非另有具体说明，本专利技术中使用的所有的技术和科学术语具有与本领域的技术人员通常所理解的意义相同的意义。通常，本专利技术中使用的命名法和描述的实验方法是广泛所知的，并在本领域中常用到的。本专利技术的专利技术人已经做了能从少量血液中获得大量NK细胞的研究，且发现通过用作为饲养细胞的经辐射的Jurkat细胞培养从外周血中分离的单个核细胞时可以获得增殖的NK细胞（韩国专利申请号10-2010-007877）。此外，本专利技术的专利技术人已对利用所述专利申请所公开的方法能够有选择地增殖NK细胞的机制做了研究，且发现从单个核细胞中去除B细胞后使所述单个核细胞与经辐射的Jurkat细胞进行共培养时会显著降低NK细胞的选择性增殖，这表明B细胞在NK细胞的增殖中起重要作用（图1A和1B）。基于这些结果，可发现，利用Jurkat细胞的NK细胞的选择性增殖取决于B细胞。从这个事实能够预期，当使用作为饲养细胞的B细胞源永生化细胞EBV-LCL时，能使更多量的NK细胞进行增殖。然而，可见当分离自外周血的单个核细胞与EBV-LCL进行共培养时，NK细胞虽有增殖，但NK细胞的纯度有显著下降。因此，本专利技术的专利技术人发现，可通过以下方式解决由单独使用Jurkat细胞或EBV-LCL细胞而引起的问题，即将经辐射的EBV-LCL细胞与经辐射的Jurkat细胞作为饲养细胞一同使用，从而可进行更高产量的单个核细胞和NK细胞的增殖。因此，本专利技术的专利技术人是基于这些事实进行研发的。因此，根据本专利技术的一方面，提供一种诱导和扩增源自外周血单个核细胞的自然杀伤细胞的方法，该方法包括：在存有细胞因子的条件下，作为饲养细胞的经辐射的Jurkat细胞和经辐射的EBV-LCL细胞与外周血单个核细胞进行共培养。在本专利技术中，“外周血单个核细胞”、“PBMCs”或“单个核细胞”是指从常用于抗癌免疫治疗的外周血中分离出的单个核细胞。通过利用已知方法，如聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度法（Ficoll-Hypaquedensitygradientmethod），可从收集的人血液中获得外周血单个核细胞。根据本专利技术的一个示例性实施例，“外周血单个核细胞”可从正常人、有患癌风险的患者或癌症患者中获取。这里使用的外周血单个核细胞无需一定要源自自体，也可以使用同种异体的外周血单个核细胞来诱导和增殖本专利技术的用于抗癌免疫治疗的NK细胞。根据本专利技术的一个示例性实施例，所述外周血单个核细胞与经辐射的Jurkat细胞和经辐射的EBV-LCL细胞进行共培养时，可以获得经增殖的单个核细胞和经增殖的自然杀伤细胞。可使用所述自然杀伤细胞处理正常人、有患癌风险的患者或癌症患者，从而预防及治疗癌症。在本专利技术中，所述术语“Jurkat细胞”或“Jurkat细胞株”是指血癌（永生急性T细胞白血病）细胞株，是由三藩市加利福尼亚大学的ArthurWeiss博士研发出来的。有表达各种趋化因子受体的Jurkat细胞株可以生成IL-2的细胞，由于在其表面上会高度表达作为天然杀伤细胞活性抑制因子的MHC-I类，从而认为所述Jurkat细胞株不可能成为用于抗癌免疫治疗的饲养细胞的候选者（饲养细胞）。然而，本专利技术的专利技术人为了从外周血单个核细胞向NK细胞的分化和NK细胞的增殖而筛选诸多血癌细胞后发现，所述Jurkat细胞能够用作饲养细胞（参照韩国专利申请号10-2010-0078777）。这里使用的Jurkat细胞可取自美国菌种保藏中心（AmericanTypeCultureCollection，ATCC;ATCCTIB-152）。在本专利技术中，所述术语“EBV-LCL细胞”或“EBV-LCL细胞株”是指由EB病毒（EBV）转化的连续性淋巴细胞株（EBV-LC本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于诱导和扩增源自外周血单个核细胞的自然杀伤（NK）细胞的方法，其中该方法包括：在存在细胞因子的条件下，将作为饲养细胞的经辐射的Jurkat细胞和经辐射的、由EB病毒转化的连续性淋巴细胞株（EBV‑LCL）细胞与外周血单个核细胞进行共培养。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.05.07 KR 10-2012-0048165;2013.05.07 KR 10-2011.用于诱导和扩增源自外周血单个核细胞的自然杀伤(NK)细胞的方法，其中该方法包括：在存在细胞因子的条件下，将作为饲养细胞的经辐射的Jurkat细胞和经辐射的、由EB病毒转化的连续性淋巴细胞株(EBV-LCL)细胞与外周血单个核细胞进行共培养。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述外周血单个核细胞是从正常人、有患癌风险的患者或癌症患者中获得的。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述经辐射的Jurkat细胞和经辐射的EBV-LCL细胞是分别通过100～500Gy的辐射处理而获得的。4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：李景美，林善雅，余嘉诚，
申请(专利权)人：高丽大学校产学协力团，
类型：发明
国别省市：韩国;KR