胎盘血CIK细胞改良的培养方法技术

本发明专利技术涉及一种胎盘血CIK细胞改良的培养方法。该方法包括：1)将由胎盘血分离得到的单核细胞接种于包被有CD3抗体及CD28抗体的培养容器中进行培养；培养体系中的细胞因子为IFN‑γ；2)向培养体系中加入IL‑2，IL‑12，IL‑15，CD16抗体；3)换液，新的培养体系中的细胞因子为IL‑2，IL‑12，IL‑15；所述培养体系中的基础培养基为含4％～6％自体血浆的GT‑T581培养基；4)补加IL‑2，培养2～4天后收获细胞。该方法CIK扩增效果好，且活化的CIK占比更高、T‑reg细胞占比更低。

Modified culture method of CIK cells from placental blood

The invention relates to an improved culture method for CIK cells of placental blood. The method includes: 1) inoculating monocytes isolated from placental blood into a culture container coated with CD3 antibody and CD28 antibody for culture; 2) adding IL_2, IL_12, IL_15, CD16 antibody to the culture system; 3) changing fluid, and the cytokines in the new culture system are IL_2, IL_12, IL_15; and the culture system is described. The basic medium was GT T581 containing 4%-6% autologous plasma. 4) The cells were harvested 2-4 days after supplementation of IL 2. The CIK amplification effect of this method is good, and the proportion of activated CIK is higher, and the proportion of T_reg cells is lower.

【技术实现步骤摘要】
胎盘血CIK细胞改良的培养方法
本专利技术涉及细胞培养
，具体而言，涉及一种胎盘血CIK细胞改良的培养方法。
技术介绍
胎盘是胎儿与母体之间物质交换的重要器官，是人类妊娠期间由胚胎胚膜和母体子宫内膜联合长成的母子间组织结合器官。胎儿在子宫中发育，依靠胎盘从母体取得营养，而双方保持相当的独立性。胎盘血的采集量一般在150mL以上，最多可以采集250mL，可采集量高于脐带血。胎盘血中富含原始造血干细胞，其数量和质量与骨髓媲美，数量高于脐带血中造血干细胞含量。白细胞含量11～19×109，远高于外周血，略高于脐带血。其中的单核细胞含量高于外周血和脐带血含量，单核细胞的含量将近脐血的2倍。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-inducedkillercells，CIK)是一群在体外经IL-1α、IL-2、IFN-γ及抗CD3单克隆抗体等诱导而成的以CD3+CD56+细胞为主的CD4+和CD8+效应T细胞群，兼具有T细胞强大的杀瘤活性以及NK细胞的非主要组织相容性复合体(MHC)限制性杀瘤的优点。与其他过继免疫治疗细胞相比，CIK具有增殖速度快、杀伤活性高、杀瘤谱广以及副作用小等特点，对正常骨髓造血功能影响甚微，被临床认为是一种有效的肿瘤免疫治疗手段。广泛应用于肾癌、黑色素瘤、肝癌、胃癌和白血病等多种恶性肿瘤的治疗。CIK可通过多种途径发挥抗肿瘤作用。CIK对肿瘤细胞有直接杀伤作用，通过分泌颗粒酶和穿孔素穿透靶细胞膜，直接导致肿瘤细胞破裂；CIK具有较强的细胞毒活性，可分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α和GM-CSF等多种细胞因子进一步提高免疫效应细胞的细胞毒作用，不仅对肿瘤细胞有直接抑制作用，还可通过调节免疫系统间接杀伤瘤细胞，诱导肿瘤细胞凋亡。现有技术中的CIK培育方法，普遍存在扩增倍率低、细胞活性差等问题。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新颖的胎盘血细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-inducedkillercells，CIK)的培养方法，该方法操作简单，培养得到CIK质量较好，可用于CIK的大量制备，使该方法更利于推广和应用。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：本专利技术涉及一种胎盘血CIK细胞改良的培养方法，包括：1)将由胎盘血分离得到的单核细胞接种于包被有CD3抗体及CD28抗体的培养容器中进行培养；培养体系中的细胞因子为IFN-γ900U/mL～1100U/mL；2)向培养体系中加入IL-2终浓度为900U/mL～1100U/mL，IL-12终浓度为1.5ng/mL～2.5ng/mL，IL-15终浓度为8ng/mL～12ng/mL，CD16抗体终浓度为1.5μg/mL～2.5μg/mL；3)换液，新的培养体系中的细胞因子为IL-2900U/mL～1100U/mL，IL-154ng/mL～6ng/mL，IL-121.5ng/mL～2.5ng/mL；所述培养体系中的基础培养基为含4％～6％自体血浆的GT-T581培养基；4)补加IL-245～55万IU/400ml，培养2～4天后收获细胞。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：CIK扩增效果好，且活化的CIK占比更高、T-reg细胞占比更低。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为对本专利技术一个实施例培养得到的CIK细胞表面标志物进行检测的结果。具体实施方式本专利技术涉及一种胎盘血CIK细胞改良的培养方法，包括：1)将由胎盘血分离得到的单核细胞接种于包被有CD3抗体及CD28抗体的培养容器中进行培养；培养体系中的细胞因子为IFN-γ900U/mL～1100U/mL；2)向培养体系中加入IL-2终浓度为900U/mL～1100U/mL，IL-12终浓度为1.5ng/mL～2.5ng/mL，IL-15终浓度为8ng/mL～12ng/mL，CD16抗体终浓度为1.5μg/mL～2.5μg/mL；3)换液，新的培养体系中的细胞因子为IL-2900U/mL～1100U/mL，IL-154ng/mL～6ng/mL，IL-121.5ng/mL～2.5ng/mL；所述培养体系中的基础培养基为含4％～6％自体血浆的GT-T581培养基；4)补加IL-245～55万IU/400ml，培养2～4天后收获细胞。在一些实施方式中，在步骤1)中，培养体系中的细胞因子为IFN-γ950U/mL～1050U/mL。在一些实施方式中，在步骤1)中，培养体系中的细胞因子为IFN-γ1000U/mL。在一些实施方式中，在步骤2)中，培养体系中加入IL-2的终浓度均为1000U/mL，IL-12终浓度为2ng/mL，IL-15终浓度为10ng/mL，CD16抗体终浓度为2μg/mL。在一些实施方式中，在步骤3)中，新的培养体系中的细胞因子为IL-2950U/mL～1050U/mL，IL-154.5ng/mL～5.5ng/mL，IL-121.7ng/mL～2.3ng/mL。在一些实施方式中，在步骤3)中，新的培养体系中的细胞因子为IL-21000U/mL，IL-155ng/mL，IL-122ng/mL；。在一些实施方式中，在步骤4)中，补加IL-250万IU/400ml。在一些实施方式中，在步骤1)中，所述培养容器包被有CD3抗体及CD28抗体的方法为：以所述培养面积为25cm2计，加入2.5～3.5mL含有CD3抗体400ng/mL～600ng/mL及CD28抗体400ng/mL～600ng/mL的包被液，在细胞培养条件下包被1.5h～2.5h。如非特别强调，本申请所述方法涉及到的细胞培养条件均在30至45℃之间和在1至10％的CO2之间，优选为36至38℃之间和在4至6％的CO2之间。加CD3，CD28的抗体是为了模拟T细胞的TCR激活和共刺激信号，是为了让T细胞活化进入到增殖的状态。在一些实施方式中，CD3抗体的浓度为500ng/mL。在一些实施方式中，CD28抗体的浓度为500ng/mL。在一些实施方式中，所述包被液的溶剂为D-PBS。在一些实施方式中，在步骤1)中，所述培养体系中的基础培养基为含4％～6％自体血浆的VIVO培养基。在一些实施方式中，在步骤1)中，所述培养体系中的基础培养基为含5％自体血浆的VIVO培养基。在一些实施方式中，在步骤1)中，以所述培养面积为25cm2计，培养基的加入量为8ml～12ml，细胞接种量为0.8×107～1.2×107。在一些实施方式中，在步骤1)中，以所述培养面积为25cm2计，培养基的加入量为10ml，细胞接种量为1.0×107。在一些实施方式中，步骤1)的培养时间为20h～28h。在一些实施方式中，步骤1)的培养时间为24h。在一些实施方式中，步骤2)的培养时间为2d～4d。在一些实施方式中，步骤2)的培养时间为3d。在一些实施方式中，在步骤3)中，所述培养体系中的基础培养基为含5％自体血浆的GT-T581培养基。在一些实施方式中，在步骤3)中，将本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种胎盘血CIK细胞改良的培养方法，其特征在于，包括：1)将由胎盘血分离得到的单核细胞接种于包被有CD3抗体及CD28抗体的培养容器中进行培养；培养体系中的细胞因子为IFN‑γ900U/mL～1100U/mL；2)向培养体系中加入IL‑2终浓度为900U/mL～1100U/mL，IL‑12终浓度为1.5ng/mL～2.5ng/mL，IL‑15终浓度为8ng/mL～12ng/mL，CD16抗体终浓度为1.5μg/mL～2.5μg/mL；3)换液，新的培养体系中的细胞因子为IL‑2 900U/mL～1100U/mL，IL‑15 4ng/mL～6ng/mL，IL‑12 1.5ng/mL～2.5ng/mL；所述培养体系中的基础培养基为含4％～6％自体血浆的GT‑T581培养基；4)补加IL‑2 45～55万IU/400ml，培养2～4天后收获细胞。

【技术特征摘要】
1.一种胎盘血CIK细胞改良的培养方法，其特征在于，包括：1)将由胎盘血分离得到的单核细胞接种于包被有CD3抗体及CD28抗体的培养容器中进行培养；培养体系中的细胞因子为IFN-γ900U/mL～1100U/mL；2)向培养体系中加入IL-2终浓度为900U/mL～1100U/mL，IL-12终浓度为1.5ng/mL～2.5ng/mL，IL-15终浓度为8ng/mL～12ng/mL，CD16抗体终浓度为1.5μg/mL～2.5μg/mL；3)换液，新的培养体系中的细胞因子为IL-2900U/mL～1100U/mL，IL-154ng/mL～6ng/mL，IL-121.5ng/mL～2.5ng/mL；所述培养体系中的基础培养基为含4％～6％自体血浆的GT-T581培养基；4)补加IL-245～55万IU/400ml，培养2～4天后收获细胞。2.根据权利要求1所述的胎盘血CIK细胞的培养方法，其特征在于，在步骤1)中，所述培养容器包被有CD3抗体及CD28抗体的方法为：以所述培养面积为25cm2计，加入2.5～3.5mL含有CD3抗体400ng/mL...

【专利技术属性】
技术研发人员：周海涛，
申请(专利权)人：药鼎北京国际细胞医学技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11