一种NK细胞exosomes可控规模化的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种NK细胞exosomes可控规模化的制备方法，包括以下步骤：(1)收集NK细胞培养基上清液，并用磷酸盐缓冲液进行稀释，得到稀释液；(2)将稀释液依次在低转速和高转速下离心，且每次离心后取上清液弃沉淀；(3)将离心上清液置于超滤管中进行离心，取上清液，得到的浓缩上清液进行超高速离心，超高速离心后取沉淀；(4)将步骤(3)超高速离心后得到的沉淀置于磷酸盐缓冲液中并转移至透析袋中进行透析，即得所述NK细胞exosomes。与现有技术相比，本发明专利技术粒径分布均匀，且表面携带标志性蛋白CD9、CD81、CD63，克服了现有制备技术存在纯度低，产量低，表征蛋白表达量低等不足，且可以直接用于后续的检测，安全系数高。

A Controllable Scale Preparation Method of NK Cell Exosomes

The invention relates to a controllable and large-scale preparation method of NK cell exosomes, which comprises the following steps: (1) collecting supernatant of NK cell culture medium and diluting it with phosphate buffer solution to obtain the diluent; (2) centrifuging the diluent at low and high rotating speeds in turn, and discarding and precipitating the supernatant after each centrifugation; (3) centrifuging the supernatant in the ultrafiltration tube and extracting the supernatant. The concentrated supernatant is centrifuged at ultra-high speed and precipitated after ultra-high speed centrifugation; (4) The precipitation obtained after ultra-high speed centrifugation is placed in phosphate buffer and transferred to dialysis bag for dialysis, which leads to the exosomes of NK cells. Compared with the existing technology, the invention has uniform particle size distribution and carries the marker proteins CD9, CD81 and CD63 on the surface, which overcomes the shortcomings of the existing preparation technology, such as low purity, low yield and low expression of the marker protein, and can be directly used for subsequent detection with high safety factor.

【技术实现步骤摘要】
一种NK细胞exosomes可控规模化的制备方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种NK细胞exosomes可控规模化的制备方法。
技术介绍
exosomes是由很多类型细胞分泌的30-150nm的“杯托状”磷脂双分子层囊泡，密度为1.13-1.19g/mL，携带多种蛋白质、脂质和核酸，功能复杂，参与免疫调节、调控细胞外基质重构、激活细胞的信号通路等。在癌症研究中，以前的研究多数是探索癌细胞释放的exosomes，但很少了解免疫细胞释放的exosomes的功能。NK细胞对转移性及血液恶性肿瘤具有天然快速免疫作用，NK细胞的抗肿瘤特性已经在临床实验阶段。然而活细胞治疗会带来固有的风险：如微血管阻塞导致肺栓塞和死亡、移植细胞转化为不良的细胞类型或癌症、免疫排斥反应、心律失常、骨化和/或钙化等。用exosomes替换细胞治疗可以避免这些问题，例如由于exosomes的小尺寸可以避免血管闭塞和不良细胞类型的产生，目前有研究(如：ZhuLetal.Theranostics,2017,7(10):2732-2745)表明NK细胞exosomes对肿瘤细胞具有细胞毒性，但是对正常细胞无影响，值得进一步研究将其发展为癌症的治疗手段。若要将NK细胞exosomes开发应用，NK细胞exosomes的高纯度大规模生产是不可回避的一环。传统的超高速离心得到的exosomes纯度尚可，但其产量不高，而根据exosomes尺寸原理设计的超滤，透析等方法又不能很好的去除与exosomes尺寸一致的杂蛋白，而聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)沉淀法和免疫磁珠法都不同程度地引入不适合临床治疗的外源性物质。虽然目前也有报道大规模NK细胞exosomes的提纯方法(如：JongAY,etal.[J].JournalofExtracellularVesicles,2017,6(1):1294368)。但NK细胞exosomes的纯度和产量问题并没有同时得到很好的解决，因此目前缺少一个能提取高纯度，高产率，高生物活性临床级别NK细胞exosomes的稳定方法。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种纯度高的临床级NK细胞exosomes可控规模化的制备方法。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：一种NK细胞exosomes可控规模化的制备方法，包括以下步骤：(1)收集NK细胞培养基上清液，并用磷酸盐缓冲液进行稀释，得到稀释液；(2)将稀释液依次在低转速和高转速下离心，且每次离心后取上清液弃沉淀，在高转速下离心后得到离心上清液；(3)将离心上清液置于超滤管中进行离心，取上清液，得到的浓缩上清液进行超高速离心，超高速离心后取沉淀；(4)将步骤(3)超速离心后得到的沉淀置于磷酸盐缓冲液中重悬稀释并转移至透析袋中进行透析，将超小分子杂质透析出去，即得所述纯化的NK细胞exosomes。优选的，所述的磷酸盐缓冲液中包含KCl、NaCl、KH2PO4和Na2HPO4，其中，所述KCl、NaCl、KH2PO4和Na2HPO4的质量比为(0.1～0.3)：(6～10)：(0.2～0.3)：(1～2)，其中，所述磷酸盐缓冲液中盐的总质量浓度为8.88～9.88g/L。优选的，所述的磷酸盐缓冲液与NK细胞培养基上清液的体积比为(1～40)：1。优选的，所述的低转速为2000～3000rpm，低转速下离心时间为5～15min，在该离心速率下，可以去除细胞。优选的，所述的高转速为8000～11000rpm，高转速下离心时间为10～35min；在该转速下离心，可以去除细胞碎片和杂质。优选的，所述超滤管的规格为100～150kDa，在超滤管中的离心转速为3000～4000rpm，离心时间为10～30min，采用超滤管离心可以去除小分子杂质的同时浓缩细胞上清液，减少接下来的超高速离心的工作量及成本。优选的，所述超高速离心的转速为8000～100000g，超高速离心的时间为60～90min，此处留取的沉淀即为外泌体颗粒。优选的，所述透析袋的孔径为30～35nm，透析时间为3～9h，透析时加入的磷酸盐缓冲液与步骤(3)超高速离心后得到的沉淀的质量比为(200～5000)：1，透析可以去除小分子杂质。优选的，整个制备过程中，温度为4～37℃，以保持NK细胞exosomes的生物活性。与现有技术相比，本专利技术的有益效果体现在以下几方面：(1)本专利技术能获得大量高纯度稳定的NK细胞exosomes，平均尺寸为30-150nm，完整的茶杯托exosomes样结构，粒径分布均匀，且表面携带标志性蛋白CD9、CD81、CD63，克服了现有制备技术存在纯度低，产量低，表征蛋白表达量低等不足；(2)本专利技术可以直接用于后续的检测，安全系数高，不会引起exosomes功能的缺失，具有较高的科学研究价值。附图说明图1为实施例1所得NK细胞exosomes的透射电子显微镜(TEM)照片；图2为实施例1所得NK细胞exosomes的WesternBlot检测结果；图3为实施例1所得NK细胞exosomes的粒径分析结果。具体实施方式下面对本专利技术的实施例作详细说明，本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。1、磷酸盐缓冲液配方：KCl200mg/L；NaCl8g/L；KH2PO4240mg/L；Na2HPO41.44g/L。2、含有NK细胞exosomes的培养上清液的获得：首先将志愿者外周血抗凝稀释，用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，4*107个单个核细胞重悬于50ml完全活化培养基(浓度为800-1,000U/mL的IL-12，800-1,000U/ml的IL-15，800-1,000U/mL的IFN-γ的DMEM培养基)中，37℃，5％CO2培养箱中培养3-5天加无exosomesNK细胞扩增培养基1,000mL(浓度为800-1,000U/mL的IL-2，800-1,000U/mL的IL-15的去exosomesRPMI-1640培养基)，继续培养8-10天获得NK细胞培养上清液实施例1(1)采用4℃条件下使用磷酸盐缓冲液对收集的NK细胞培养上清液进行稀释，离心3,000rpm,8min，沉淀为细胞，去除沉淀，留取上清；(2)将步骤(1)得到的上清液在4℃条件下以9,000rpm的转速15min离心，留取上清液，弃沉淀；(3)用4℃条件下磷酸盐缓冲液稀释步骤(2)中得到的上清液的，继续用110kDa超滤管以3,500rpm的速度离心5min，去除小分子杂质的同时浓缩细胞上清液，减少接下来的超高速离心的工作量及成本；(4)将步骤(3)得到的浓缩上清液以4℃条件下100,000g的转速离心60min，离心结束后，弃上清，留住沉淀；(5)将步骤(4)得到的沉淀用磷酸盐缓冲液重悬转移至透析袋中，透析8h即可得到目标高纯度大量的exosomes，损失率极低；本专利技术使用透射电子显微镜(TEM)、蛋白质印迹法(WesternBlot)、纳米颗粒跟踪分析(NanoparticleTrackingAnalysis)对获得的NK细胞exosomes进行表征，具体表征结果本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种NK细胞exosomes可控规模化的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)收集NK细胞培养基上清液，并用磷酸盐缓冲液进行稀释，得到稀释液；(2)将稀释液依次在低转速和高转速下离心，且每次离心后取上清液弃沉淀，在高转速下离心后得到离心上清液；(3)将离心上清液置于超滤管中进行离心，取上清液，得到的浓缩上清液进行超高速离心，超高速离心后取沉淀；(4)将步骤(3)超高速离心后得到的沉淀置于磷酸盐缓冲液中并转移至透析袋中进行透析，即得所述NK细胞exosomes。

【技术特征摘要】
1.一种NK细胞exosomes可控规模化的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)收集NK细胞培养基上清液，并用磷酸盐缓冲液进行稀释，得到稀释液；(2)将稀释液依次在低转速和高转速下离心，且每次离心后取上清液弃沉淀，在高转速下离心后得到离心上清液；(3)将离心上清液置于超滤管中进行离心，取上清液，得到的浓缩上清液进行超高速离心，超高速离心后取沉淀；(4)将步骤(3)超高速离心后得到的沉淀置于磷酸盐缓冲液中并转移至透析袋中进行透析，即得所述NK细胞exosomes。2.根据权利要求1所述的一种NK细胞exosomes可控规模化的制备方法，其特征在于，所述的磷酸盐缓冲液中包含KCl、NaCl、KH2PO4和Na2HPO4，其中，所述KCl、NaCl、KH2PO4和Na2HPO4的质量比为(0.1～0.3)：(6～10)：(0.2～0.3)：(1～2)，其中，所述磷酸盐缓冲液中盐的总质量浓度为8.88-9.88g/L。3.根据权利要求1所述的一种NK细胞exosomes可控规模化的制备方法，其特征在于，所述的磷酸盐缓冲液与NK细胞培养基上清液的体积比为(1～40)：1。4.根据权利要求1所述的一种NK细胞e...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔大祥，潘少君，张倩，章阿敏，黄志成，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海,31