一种负载肿瘤细胞外泌体的DC-CIK细胞的培养方法技术

本发明专利技术涉及DC‑CIK细胞培养领域，特别涉及一种负载肿瘤细胞外泌体的DC‑CIK细胞的培养方法，包括以下步骤：CIK细胞和负载肿瘤细胞外泌体的外周血DC细胞共同培养，培养65‑75小时后，添加IL‑2，以培养液的体积算，添加的IL‑2的量为1000‑1500IU/mL，继续培养65‑75小时，即得；用CIK培养基进行培养：GT‑T581培养基、自体血浆和IL‑2，自体血浆为GT‑T581培养基体积的5％±0.5％，IL‑2 1000±100IU/mL。该培养方法通过CIK细胞和负载肿瘤细胞外泌体的外周血DC细胞以一定的方式进行培养，得到的负载肿瘤细胞外泌体的DC‑CIK细胞具有良好的杀伤力。

A Culture Method of DC-CIK Cells Loaded with Tumor Exosomes

The present invention relates to the field of DC_CIK cell culture, in particular to a culture method of DC_CIK cells loaded with tumor cell exosomes, including the following steps: CIK cells and peripheral blood DC cells loaded with tumor cell exosomes are co-cultured, and after 65_75 hours of culture, IL_2 is added, which is calculated by volume of culture medium, and the amount of added IL_2 is 1000_1500IU/mL, and 65_75_75. Cultured in CIK medium: GT T581 medium, autologous plasma and IL 2. Autologous plasma was 5%+0.5% of the volume of GT T581 medium, and IL 2 000+100 IU/mL. In this method, CIK cells and peripheral blood DC cells loaded with tumor cell exosomes were cultured in a certain way, and the DC CIK cells loaded with tumor cell exosomes had good killing power.

【技术实现步骤摘要】
一种负载肿瘤细胞外泌体的DC-CIK细胞的培养方法
本专利技术涉及DC-CIK细胞培养领域，具体而言，涉及一种负载肿瘤细胞外泌体的DC-CIK细胞的培养方法。
技术介绍
细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-inducedkillercells，CIK)是一群在体外经IL-1α、IL-2、IFN-γ及抗CD3单克隆抗体等诱导而成的以CD3+CD56+细胞为主的CD4+和CD8+效应T细胞群，兼具有T细胞强大的杀瘤活性以及NK细胞的非主要组织相容性复合体(MHC)限制性杀瘤的优点。与其他过继免疫治疗细胞相比，CIK具有增殖速度快、杀伤活性高、杀瘤谱广以及副作用小等特点，对正常骨髓造血功能影响甚微，被临床认为是一种有效的肿瘤免疫治疗手段。广泛应用于肾癌、黑色素瘤、肝癌、胃癌和白血病等多种恶性肿瘤的治疗。CIK可通过多种途径发挥抗肿瘤作用。CIK对肿瘤细胞有直接杀伤作用，通过分泌颗粒酶和穿孔素穿透靶细胞膜，直接导致肿瘤细胞破裂；CIK具有较强的细胞毒活性，可分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α和GM-CSF等多种细胞因子进一步提高免疫效应细胞的细胞毒作用，不仅对肿瘤细胞有直接抑制作用，还可通过调节免疫系统间接杀伤瘤细胞，诱导肿瘤细胞凋亡。现有DC细胞负载肿瘤抗原的方法多位裂解肿瘤细胞或者肿瘤组织，提取其中的蛋白后进行负载。提取的蛋白成分复杂，含有需要胞内抗原，激活DC后，DC进入体内提呈给T细胞，但该抗原表达于肿瘤细胞的胞内，因为无法起到特异性杀伤作用。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
树突状细胞(Dendriticcells，DCs)是体内最有效的抗原提呈细胞，表面表达B7、MHC-Ⅱ类分子、ICAM-1等多种共刺激分子，激活辅助T细胞，促使其分泌IL-2等细胞因子，传递特异性抗原信号，最终活化细胞毒性T细胞，因此，DC细胞在体内起到启动一系列免疫反应的关键作用，在机体的免疫功能以及肿瘤的免疫治理中有重要意义。大多数DC细胞来源于骨髓，由骨髓进入外周血，再分布到全身各组织中，DC广泛分布于除脑以外的全身各脏器，但数量极少，仅占外周血单个核细胞的1％以下。DC前体细胞随血液分布到肠道、心、肝等各非淋巴器官后，发育为未成熟DC细胞。此时，DC细胞具有较强的抗原摄取加工能力，而激活T细胞的能力低下。处于各种非淋巴组织中的未成熟DC细胞摄取抗原后，到达淋巴结、脾脏，此后DC细胞摄取抗原加工的能力减弱直至消失，而致敏T淋巴细胞、启动免疫反应的能力增强，成为成熟DC细胞。在体外培养淋巴细胞的过程中，为了最大程度活化T细胞，需要加入成熟的DC细胞以致敏T细胞。DC细胞的体外培养，通常以外周血单个核细胞作为前体细胞诱导未成熟的DC的细胞。DC细胞促成熟过程非常复杂，涉及到多种因子的共同作用，诸如GM-CSF、TNF、IL-6、IL-4、IL-1β、PGE2、polyI:C、CD40L等等。外泌体(exosomes)，是一种脂质分子膜包裹的小囊泡。电镜下观察呈杯状，直径约为40-100nm，密度约为1.13-1.19g/mL。外泌体含有来源细胞的胞质和脂质包膜成分，外泌体内部包含有丰富的mRNA，microRNA和蛋白质成分。外泌体形成是通过多囊泡胞内体(MVE)的细胞区室向内出芽的形式形成，内囊泡内含有蛋白质、microRNA及mRNA。当MVE与细胞膜融合时，内囊泡就被释放到细胞外成为外泌体，释放出来的外泌体能够运行到距离较远的组织而影响细胞的行为和生理上的改变。在肿瘤发生发展的过程中，外泌体参与细胞间的信息传递，进而促进肿瘤血管的生成和实体瘤的转移，肿瘤来源的外泌体已经成为肿瘤分子生物研究的热点之一。恶性肿瘤细胞通过其细胞环境的改变来调节自身的发生、发展和转移，且这种调节可以通过外泌体和肿瘤细胞分泌因子发生。肿瘤细胞来源外泌体既可帮助肿瘤细胞逃逸免疫监视，也可激活肿瘤特异性免疫应答。肿瘤来源外泌体内包含肿瘤特异性抗原，可以在体外产生MHCⅠ类限制性T细胞克隆，且肿瘤来源外泌体可以在体内驱动依赖T细胞的交叉保护作用对抗同源和异源肿瘤。肿瘤细胞所释放的外泌体表面携带有MHC分子和抗原肽，可以增强DC-CIK的细胞毒活性，刺激产生特异性的抗瘤T细胞，并得到具有特异性和非特异性双重抗瘤作用的DC-CIK细胞，对未来肿瘤的治疗提供了一种不同以往的方法。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种负载肿瘤细胞外泌体的DC-CIK细胞的培养方法，包括以下步骤：CIK细胞和负载肿瘤细胞外泌体的外周血DC细胞共同培养，培养65-75小时后，添加IL-2，以培养液的体积算，添加的IL-2的量为1000-1500IU/mL，继续培养65-75小时，得到负载肿瘤细胞外泌体的DC-CIK细胞；其中，培养以及添加的培养基均为CIK培养基，所述CIK培养基的组分为：GT-T581培养基、自体血浆和IL-2，所述自体血浆的含量为所述GT-T581培养基体积的5％±0.5％，所述IL-2终浓度为1000±100IU/mL。本专利技术提供的负载肿瘤细胞外泌体的DC-CIK细胞的培养方法，通过CIK细胞和负载肿瘤细胞外泌体的外周血DC细胞以一定的方式进行培养，得到的负载肿瘤细胞外泌体的DC-CIK细胞具有良好的杀伤力。进一步地，CIK细胞和负载肿瘤细胞外泌体的外周血DC细胞共同培养时，所用的培养容器以T175培养瓶计，添加的CIK培养基的体积为80±10mL。进一步地，培养65-75小时后还包括扩大培养的步骤，具体为：细胞转移到培养袋中培养，添加的CIK培养基的体积为400±50mL，培养65-75小时后，添加IL-2。进一步地，所述CIK细胞通过以下方法制备：所述CIK细胞通过以下方法制备：培养容器表面包被后，接入PBMC进行培养，其中，培养所用的培养液为含4％～6％自体血浆的VIVO培养基，在其中加入IFN-γ，IFN-γ在培养液中的终浓度为1000±100U/mL；培养20-24小时后，在培养液中加入IL-2、IL-12、IL-15和CD16，其中，在培养液中，IL-2浓度为1000±100U/mL、IL-12浓度为2.5±0.2ng/mL、IL-15浓度为10±2ng/mL，CD16浓度为2±0.2μg/mL继续培养；培养65-75小时后，细胞转移到新的培养容器，在所述CIK培养基中培养，得到所述CIK细胞。进一步地，所述培养液的组分包括VIVO培养基、自体血浆，所述自体血浆的含量为所述VIVO培养基体积的5％±0.5％。进一步地，所述包被采用包被液进行，所述包被液的组分包括D-PBS、CD3和CD28，所述CD3的终浓度为500±50ng/mL，所述CD28的终浓度为500±50ng/mL。包被液包被时，以T25培养瓶计，加入3mL包被液，置于培养箱中包被2h；倒去包被液，即可得到培养容器表面包被的培养容器。之后，以T25培养瓶计，接种的PBMC个数为0.5×107-2.0×107；接种后，加10±2mL上述的培养液即CIK初始培养基，同时加入IFN-γ使其终浓度为1000±100U/mL，进行培养。进一步地，细胞转移到新的培养容器，一般是T75培养瓶，加入CIK培养基20±5mL进行培养。本专利技术中，对培养条件未特别说明的话，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种负载肿瘤细胞外泌体的DC‑CIK细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：CIK细胞和负载肿瘤细胞外泌体的外周血DC细胞共同培养，培养65‑75小时后，添加IL‑2，以培养液的体积算，添加的IL‑2的量为1000‑1500IU/mL，继续培养65‑75小时，得到负载肿瘤细胞外泌体的DC‑CIK细胞；其中，培养以及添加的培养基均为CIK培养基，所述CIK培养基的组分为：GT‑T581培养基、自体血浆和IL‑2，所述自体血浆的含量为所述GT‑T581培养基体积的5％±0.5％，所述IL‑2终浓度为1000±100IU/mL。

【技术特征摘要】
1.一种负载肿瘤细胞外泌体的DC-CIK细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：CIK细胞和负载肿瘤细胞外泌体的外周血DC细胞共同培养，培养65-75小时后，添加IL-2，以培养液的体积算，添加的IL-2的量为1000-1500IU/mL，继续培养65-75小时，得到负载肿瘤细胞外泌体的DC-CIK细胞；其中，培养以及添加的培养基均为CIK培养基，所述CIK培养基的组分为：GT-T581培养基、自体血浆和IL-2，所述自体血浆的含量为所述GT-T581培养基体积的5％±0.5％，所述IL-2终浓度为1000±100IU/mL。2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述CIK细胞通过以下方法制备：培养容器表面包被后，接入PBMC进行培养，其中，培养所用的培养液为含4％～6％自体血浆的VIVO培养基，在其中加入IFN-γ，IFN-γ在培养液中的终浓度为1000±100U/mL；培养20-24小时后，在培养液中加入IL-2、IL-12、IL-15和CD16，其中，在培养液中，IL-2浓度为1000±100U/mL、IL-12浓度为2.5±0.2ng/mL、IL-15浓度为10±2ng/mL，CD16浓度为2±0.2μg/mL继续培养；培养65-75小时后，细胞转移到新的培养容器，在所述CIK培养基中培养，得到所述CIK细胞；进一步地，所述培养液的组分包括VIVO培养基、自体血浆，所述自体血浆的含量为所述VIVO培养基体积的5％±0.5％；进一步地，所述包被采用包被液进行，所述包被液的组分包括D-PBS、CD3和CD28，所述CD3的终浓度为500±50ng/mL，所述CD28的终浓度为500±50ng/mL。3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述负载肿瘤细胞外泌体的外周血DC细胞通过以下方法制备：(a)PBMC细胞贴壁培养，去除培养液，洗涤细胞；(b)然后加入DC培养基，培养64-80h；(c)拍打培养瓶，使贴壁细胞漂浮，补加DC培养基和肿瘤细胞外泌体，培养40-50h；(d)将细胞悬浮后收集，得到细胞，将细胞转移到已采用自体血浆包被的培养容器中，加入DC成熟培养基，培养45-55h，得到负载肿瘤细胞外泌体的外周血DC细胞；进一步地，所述DC成熟培养基，以AIM-V培养基为基准，按以下含量添加以下组分：自体血浆体积百分数为1％±0.2％，GM-CSF50±2ng/mL，IL-450±2ng/mL，TNF-α10±2ng/mL，PGE-21±0.2μg/mL。4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，步骤(a)中，所述PBMC细胞贴壁培养具体步骤为：以T175培养瓶计，接入PBMC细胞1×108-1.5×108个，同时加入AIM-V培养基50-60mL和自体血浆，所述自体血浆的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张权，
申请(专利权)人：见多视光北京科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11