外周血来源的树突状细胞培养方法技术

本发明专利技术涉及细胞培养技术领域，具体而言，涉及一种外周血来源的树突状细胞培养方法，所述方法包括如下步骤：1)将从外周血中分离得到的PBMC细胞使用培养基A培养，得到离体未成熟树突状细胞；2)将所述离体未成熟树突状细胞在培养基B中培养，得到成熟树突状细胞；其中，所述培养基A为额外添加包括下列成分的AIM‑V培养基：0.8～1.2v/v％自体血浆、GM‑CSF 40～60ng/mL、IL‑4 40～60ng/mL；所述培养基B为在所述培养基A的基础上额外添加TNF‑α7～13ng/mL以及PEG‑2 0.8～1.2μg/mL。本发明专利技术通过优化培养流程，筛选和优化诱导成熟因子组分，大大提高了成熟DC细胞的比例，提高了细胞质量，还能降低培养成本。

Culture of dendritic cells from peripheral blood

The invention relates to the technical field of cell culture, in particular to a method for culturing dendritic cells derived from peripheral blood. The method comprises the following steps: 1) culturing PBMC cells isolated from peripheral blood in medium A to obtain immature dendritic cells in vitro; 2) culturing the immature dendritic cells in medium B to obtain mature dendritic cells in vitro. Cells; the medium A is an A IM_V medium supplemented with 0.8-1.2v/v% autologous plasma, GM_CSF 40-60ng/mL, IL_4 40-60ng/mL, and the medium B is supplemented with TNF_alpha 7-13ng/mL and PEG_2.8-1.2ug/mL on the basis of the medium A. The method greatly improves the proportion of mature DC cells, improves the cell quality and reduces the culture cost by optimizing the culture process, screening and optimizing the components of induction maturation factors.

【技术实现步骤摘要】
外周血来源的树突状细胞培养方法
本专利技术涉及细胞培养
，具体而言，涉及一种外周血来源的树突状细胞培养方法。
技术介绍
树突状细胞(Dendriticcells，DCs)是体内最有效的抗原提呈细胞，表面表达B7、MHC-Ⅱ类分子、ICAM-1等多种共刺激分子，激活辅助T细胞，促使其分泌IL-2等细胞因子，传递特异性抗原信号，最终活化细胞毒性T细胞，因此DC细胞在体内起到启动一系列免疫反应的关键作用，在机体的免疫功能以及肿瘤的免疫治理中有重要意义。大多数DC细胞来源于骨髓，由骨髓进入外周血，再分布到全身各组织中，DC广泛分布于除脑以外的全身各脏器，但数量极少，仅占外周血单个核细胞的1％以下。DC前体细胞随血液分布到肠道、心、肝等各非淋巴器官后，发育为未成熟DC细胞。此时，DC细胞具有较强的抗原摄取加工能力，而激活T细胞的能力低下。处于各种非淋巴组织中的未成熟DC细胞摄取抗原后，到达淋巴结、脾脏，此后DC细胞摄取抗原加工的能力减弱直至消失，而致敏T淋巴细胞、启动免疫反应的能力增强，成为成熟DC细胞。在体外培养淋巴细胞的过程中，为了最大程度活化T细胞，需要加入成熟的DC细胞以致敏T细胞。DC细胞的体外培养，通常以外周血单个核细胞作为前体细胞诱导未成熟的DC的细胞。DC细胞促成熟过程非常复杂，涉及到多种因子的共同作用，诸如GM-CSF、TNF、IL-6、IL-4、IL-1β、PGE2、polyI:C、CD40L等等。成熟的DC细胞高表达MHC-I、MHC-Ⅱ类分子，以及CD80、CD86、CD40和ICAM-1等免疫分子，能够与T淋巴细胞之间的黏附分子及配体相互作用，从而激活T淋巴细胞。但DC细胞诱导成熟过程复杂，现诱导技术成熟DC细胞比例较低，因而不能有效活化T淋巴细胞。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新颖的外周血来源的树突状细胞培养方法，该方法操作简单，培养得到树突状细胞(Dendriticcells，DCs)质量较好，可用于树突状细胞的大量制备，使该制备方法更利于推广和应用。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：本专利技术涉及一种外周血来源的树突状细胞培养方法，包括如下步骤：1)将从外周血中分离得到的PBMC细胞使用培养基A培养，得到离体未成熟树突状细胞；2)将所述离体未成熟树突状细胞在培养基B中培养，得到成熟树突状细胞；其中，所述培养基A为额外添加包括下列成分的AIM-V培养基：0.8～1.2％自体血浆、GM-CSF40～60ng/mL、IL-440～60ng/mL；所述培养基B为在所述培养基A的基础上额外添加TNF-α7～13ng/mL以及PEG-20.8～1.2μg/mL。本专利技术通过两步培养，能更好地诱导DC细胞成熟，所得到的DC细胞质量高，完全超出临床使用标准。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术通过优化培养流程，筛选和优化诱导成熟因子组分，大大提高了成熟DC细胞的比例，提高了细胞质量，还能降低培养成本。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为对本专利技术一个实施例培养得到的树突状细胞表面标志物进行检测的结果。具体实施方式为了促进理解本文描述的实施方式这一目的，将参考某些实施方式，并且将使用特定语言来描述这些实施方式。本文所使用的术语仅用于描述具体实施方式目的，而不旨在限制本公开的范围。具体的，本专利技术涉及一种外周血来源的树突状细胞培养方法，包括如下步骤：1)将从外周血中分离得到的PBMC细胞使用培养基A培养，得到离体未成熟树突状细胞；2)将所述离体未成熟树突状细胞在培养基B中培养，得到成熟树突状细胞；其中，所述培养基A为额外添加包括下列成分的AIM-V培养基：0.8～1.2v/v％自体血浆、GM-CSF40～60ng/mL、IL-440～60ng/mL；所述培养基B为在所述培养基A的基础上额外添加TNF-α7～13ng/mL以及PEG-20.8～1.2μg/mL。在一些实施方式中，所述培养基A为额外添加包括下列成分的AIM-V培养基：0.9～1.1v/v％自体血浆、GM-CSF45～55ng/mL、IL-445～55ng/mL。在一些实施方式中，所述培养基A为额外添加包括下列成分的AIM-V培养基：1.0v/v％自体血浆、GM-CSF50ng/mL、IL-450ng/mL。在一些实施方式中，所述培养基B为在所述培养基A的基础上额外添加TNF-α8～12ng/mL以及PEG-20.9～1.1μg/mL。在一些实施方式中，所述培养基B为在所述培养基A的基础上额外添加TNF-α10ng/mL以及PEG-21.0μg/mL。在一些实施方式中，所述方法涉及到的细胞培养条件均在30至45℃之间和在1至10％的CO2之间，优选为36至38℃之间和在4至6％的CO2之间。在一些实施方式中，在使用培养基A培养之前还包括贴壁培养，在所述贴壁培养中，PBMC细胞的接种密度为4～6×107/20ml。在一些实施方式中，PBMC细胞的接种密度还可以选择为5×107/20ml。在一些实施方式中，以所述贴壁培养所用培养瓶的可用的细胞培养面积175cm2计，所述贴壁培养所用的培养基的添加量为15～25ml，还可以选择20ml。在一些实施方式中，所述贴壁培养所用的培养基为包含0.8～1.2v/v％自体血浆的AIM-V培养基。在一些实施方式中，所述贴壁培养所用的培养基为包含1.0v/v％自体血浆的AIM-V培养基。在一些实施方式中，以步骤1)培养所用培养瓶的可用的细胞培养面积175cm2计，步骤1)培养所用的培养基的添加量为25～35ml，还可以选择30ml。在一些实施方式中，步骤1)的培养时间为4d～6d，也可以选择5d。在一些实施方式中，在培养的第2d～4d时(或3d时)，补加培养基A。在一些实施方式中，以步骤1)培养所用培养瓶的可用的细胞培养面积175cm2计，补加培养基A的量为15～25ml，还可以选择20ml。在一些实施方式中，在将所述离体未成熟树突状细胞从培养基A转移到培养基B中时，将培养基A中的细胞收集到离心管中，离心后去上清，用培养基B重悬沉淀并转移到新培养瓶中；在一些实施方式中，所述离心的条件为1300～1500rpm离心3min～7min；在一些实施方式中，所述将培养基A中的细胞收集到离心管中的过程包括：a).先将含有游离细胞的培养基A收集到离心管中；b).将培养瓶中加入缓冲液，置于2℃～6℃的温度中5min～15min后拍打培养瓶，收集缓冲液；任选的，重复步骤b)一次或多次。在一些实施方式中，在步骤2)中，培养时所用的培养瓶预先经过自体血浆包被。血浆包被可抑制单核细胞向巨噬细胞分化，自体血浆为DC细胞原先的生长环境一致，是促进单核细胞向DC细胞分化的理想基质。在一些实施方式中，所述包被的方法包括：以瓶底培养面积为75cm2计，加入6ml～8ml自体血浆包被8h～16h。在一些实施方式中，所述包被的方法包括：以瓶底培养面积为7本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种外周血来源的树突状细胞培养方法，其特征在于，包括如下步骤：1)将从外周血中分离得到的PBMC细胞使用培养基A培养，得到离体未成熟树突状细胞；2)将所述离体未成熟树突状细胞在培养基B中培养，得到成熟树突状细胞；其中，所述培养基A为额外添加包括下列成分的AIM‑V培养基：0.8～1.2v/v％自体血浆、GM‑CSF 40～60ng/mL、IL‑4 40～60ng/mL；所述培养基B为在所述培养基A的基础上额外添加TNF‑α7～13ng/mL以及PEG‑2 0.8～1.2μg/mL。

【技术特征摘要】
1.一种外周血来源的树突状细胞培养方法，其特征在于，包括如下步骤：1)将从外周血中分离得到的PBMC细胞使用培养基A培养，得到离体未成熟树突状细胞；2)将所述离体未成熟树突状细胞在培养基B中培养，得到成熟树突状细胞；其中，所述培养基A为额外添加包括下列成分的AIM-V培养基：0.8～1.2v/v％自体血浆、GM-CSF40～60ng/mL、IL-440～60ng/mL；所述培养基B为在所述培养基A的基础上额外添加TNF-α7～13ng/mL以及PEG-20.8～1.2μg/mL。2.根据权利要求1所述的外周血来源的树突状细胞培养方法，其特征在于，在使用培养基A培养之前还包括贴壁培养，在所述贴壁培养中，PBMC细胞的接种密度为4～6×107/20ml。3.根据权利要求2所述的外周血来源的树突状细胞培养方法，其特征在于，所述贴壁培养所用的培养基为包含0.8～1.2v/v％自体血浆的AIM-V培养基。4.根据权利要求1～3任一项所述的外周血来源的树突状细胞培养方法，其特征在于，步骤1)的培养时间为4d～6d。5.根据权利要求4所述的外周血来源的树突状细胞培养方法，其特征在于，在培养的...

【专利技术属性】
技术研发人员：程旭东，
申请(专利权)人：中生康元生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11