成熟树突状细胞的培养试剂及培养方法技术

本发明专利技术公开了一种成熟树突状细胞的培养试剂及培养方法。本发明专利技术的DC培养试剂包括不成熟DC诱导剂、成熟DC诱导剂、不成熟DC活化剂、ICOS抗体、抗原。本发明专利技术通过不成熟DC诱导、不成熟DC活化、抗原和抗体负载、成熟DC诱导几个环节使得DC培养方案能够有效提高DC的得率和活性，刺激CTL以后可有效提高CTL细胞的杀伤活性。

Culture reagents and methods of mature dendritic cells

【技术实现步骤摘要】
成熟树突状细胞的培养试剂及培养方法
本专利技术属于细胞培养
，涉及一种成熟树突状细胞的培养试剂及培养方法。
技术介绍
树突状细胞(DendriticCells，DC)是1973年美国Rockkflle大学Steinman和Cohn在观察脾脏细胞时发现的，因其成熟时有树突样或伪足样突起而得名。DC来源于造血干细胞，广泛分布在淋巴组织和非淋巴组织中，是目前已知的功能最强的专职抗原提呈细胞，其膜表面高表达MHC-Ⅱ类分子，能有效刺激初始型T细胞活化，其抗原提呈能力远强于巨噬细胞和B细胞，因此，DC是机体免疫应答的主要启动者，在肿瘤免疫中亦发挥关键作用。国内外学者应用各种方法将DC进行处理，在体外扩增活化，并予以相应的抗原刺激以制成DC疫苗，然后回输至患者体内进行免疫治疗。体细胞治疗是指应用于人的自体或异体的体细胞，经体外操作后回输(或植入)人体的治疗方法。这种体外操作包括细胞在体外的传代、扩增、筛选以及药物或其他能改变细胞生物学行为的处理，经过体外操作后的体细胞可用于疾病的治疗，也可用于疾病的诊断和预防。目前临床中应用较为成熟的自体免疫细胞治疗技术是肿瘤生物治疗的重要方法之一，是在多种免疫活性因子的作用下，有效活化和扩增从自体外周血中分离的免疫活性细胞，回输入患者体内，直接杀伤或诱导免疫效应细胞杀伤肿瘤细胞，或调节和增强机体的免疫功能。自体免疫细胞治疗技术包括细胞因子诱导的杀伤细胞免疫治疗、树突状细胞免疫治疗、DC-CIK细胞免疫治疗、自然杀伤细胞免疫治疗等。近年来，以树突状细胞为基础的肿瘤免疫治疗及DC疫苗已取得较大进展，体外制备的DC疫苗显示出明显诱发抗肿瘤免疫应答的能力，具有良好的临床应用前景。目前，从外周血单个核细胞经GM-CSF、IL-4体外诱导培养DC的方法已基本得到公认，但DC体外促成熟的方案尚没有统一的标准，目前现有DC培养技术，DC得率低，活性低，刺激T细胞效率不够高，致使培养得到的DC功能缺陷，很大程度上限制了DC疫苗的临床应用工作的开展。因此，有必要对现有DC培养方案进行进一步完善，以有效提高DC疫苗在诱导抗炎或抗肿瘤免疫应答中的作用。
技术实现思路
为了克服现有技术缺陷，本专利技术提供了一种成熟树突状细胞的培养试剂及培养方法。本专利技术提供的DC培养方案能够有效提高DC的得率和活性，刺激CTL以后可有效提高CTL细胞的杀伤活性。本专利技术的具体方案如下所示：本专利技术提供了一种DC培养试剂，所述DC培养试剂包括成熟DC诱导剂、不成熟DC诱导剂、不成熟DC活化剂、ICOS抗体、抗原。进一步，所述成熟DC诱导剂包括GM-CSF、IL-4、TNF-α、PGE-2。进一步，所述不成熟DC诱导剂包括GM-CSF、IL-4。进一步，所述不成熟DC活化剂包括Flt3L、SCF、KLH。优选地，GM-CSF浓度为50ng/mL，IL-4浓度为50ng/mL，TNF-α浓度为10ng/mL，PGE-2浓度为1μg/mL。优选地，Flt3L浓度为50ng/mL，SCF浓度为200ng/mL、KLH浓度为50μg/mL。更进一步，所述成熟DC诱导剂和不成熟DC诱导剂还包括含有血浆的无血清培养基。在本专利技术的具体实施方案中，含有血浆的无血清培养基是含有1％自体血浆的AIM-V培养基。本专利技术提供了一种成熟DC培养方法，所述培养方法包括如下步骤：(1)获取PBMC；(2)将PBMC诱导成不成熟DC，并活化不成熟DC；(3)将活化后的不成熟DC负载抗原和ICOS抗体；(4)利用前面所述的成熟DC诱导剂将步骤3获得的不成熟DC诱导成成熟DC。优选地，树突状细胞前体单核细胞来源于新鲜外周血，相比经过冷库储存或者培养传代之后的树突状细胞，从新鲜血液中制备的树突状细胞前体单核细胞离体时间较短，其细胞活性和状态的减弱或者形态改变程度都较少，更加利于保持其免疫性能。在本专利技术中，树突状细胞前体单核细胞PBMC的具体获取过程为：单采机采外周血，75％酒精擦拭采血袋，放入生物安全柜内；将血转移入50mL离心管中，2200rpm离心10min，吸走血浆，加入PBS至原体积，将稀释后血液按体积比1:1缓缓加入到提前准备好的ficoll分离液上方，轻拿轻放不破坏上下层液面；离心机参数设置为升9降6，2000rpm，15min；离心完成后轻轻吸取白膜层，PBS离心清洗3次。前面所述的培养方法中步骤2的具体操作如下：a、培养瓶包被前面所述的不成熟DC活化剂；b、将PBMC接种到经步骤a处理的培养瓶中，加入前面所述的不成熟DC诱导剂培养。更进一步，步骤2的具体操作如下：取出提前隔夜4℃包被50ng/mL的Flt3L，200ng/mL的SCF、50μg/mL的KLH的T175培养瓶，轻轻倒去PBS，将得到的PBMC加到培养瓶中，每瓶细胞数1.5*108，加入含有1％自体血浆、浓度为50ng/mL的GM-CSF、浓度为50ng/mL的IL-4的AIM-V培养基，培养箱贴壁培养；培养2h后，取出培养瓶，倒去上清液，加入30mLAIM-V培养基轻轻清洗培养瓶，加入配好的含有1％自体血浆、浓度为50ng/mL的GM-CSF、浓度为50ng/mL的IL-4的AIM-V培养基30mL，培养箱培养2天。前面所述的培养方法中步骤3的具体操作如下：a、培养第3天，取出经步骤2获得的不成熟DC，拍打培养瓶，使尽量多的贴壁细胞漂浮；补加含有1％自体血浆、浓度为50ng/mL的GM-CSF、浓度为50ng/mL的IL-4的AIM-V培养基30mL和抗原；b、培养第4天，取一个新的T75培养瓶，加入7mLPBS，加入ICOS抗体30μg/mL。前面所述的培养方法中步骤4的具体操作如下：培养第5天，取出经步骤3处理的不成熟DC，拍打培养瓶，将细胞收集到50mL离心管内；向培养瓶中加15mL冷PBS，置于4℃15min；取出培养瓶，拍打，大部分细胞漂浮，将剩余细胞转入50mL离心管，1400rpm，5min，离心后将细胞转移入第4天包被的T75瓶，加入含有1％自体血浆、浓度为50ng/mL的GM-CSF，浓度为50ng/mL的IL-4，浓度为10ng/mL的TNF-α，浓度为1μg/mL的PGE-2的AIM-V培养基30mL培养。第7天，收获成熟大量高活性细胞。本专利技术还提供了根据前面所述的培养方法制备的成熟DC。本专利技术还提供了前面所述的DC培养试剂在前面所述的培养方法中的应用。本专利技术还提供了前面所述的DC培养试剂在制备成熟DC中的应用。本专利技术的优点和有益效果：与现有培养树突状细胞的方式相比，本专利技术通过不成熟DC诱导、不成熟DC活化、抗原和抗体负载、成熟DC诱导几个环节，有效促进树突状细胞的细胞活性，提高树突状细胞的增值率及成熟率，进而提高树突状细胞的抗原提呈能力。本专利技术提供的DC培养方案能够有效提高DC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种DC培养试剂，所述DC培养试剂包括成熟DC诱导剂、不成熟DC诱导剂、不成熟DC活化剂、ICOS抗体、抗原；所述成熟DC诱导剂包括GM-CSF、IL-4、TNF-α、PGE-2；所述不成熟DC诱导剂包括GM-CSF、IL-4；所述不成熟DC活化剂包括Flt3L、SCF、KLH；/n优选地，GM-CSF浓度为50ng/mL，IL-4浓度为50ng/mL，TNF-α浓度为10ng/mL，PGE-2浓度为1μg/mL；/n优选地，Flt3L浓度为50ng/mL，SCF浓度为200ng/mL、KLH浓度为50μg/mL。/n更优选地，所述成熟DC诱导剂和不成熟DC诱导剂还包括含有血浆的无血清培养基；最优选地，含有血浆的无血清培养基是含有1％自体血浆的AIM-V培养基。/n

【技术特征摘要】
1.一种DC培养试剂，所述DC培养试剂包括成熟DC诱导剂、不成熟DC诱导剂、不成熟DC活化剂、ICOS抗体、抗原；所述成熟DC诱导剂包括GM-CSF、IL-4、TNF-α、PGE-2；所述不成熟DC诱导剂包括GM-CSF、IL-4；所述不成熟DC活化剂包括Flt3L、SCF、KLH；
优选地，GM-CSF浓度为50ng/mL，IL-4浓度为50ng/mL，TNF-α浓度为10ng/mL，PGE-2浓度为1μg/mL；
优选地，Flt3L浓度为50ng/mL，SCF浓度为200ng/mL、KLH浓度为50μg/mL。
更优选地，所述成熟DC诱导剂和不成熟DC诱导剂还包括含有血浆的无血清培养基；最优选地，含有血浆的无血清培养基是含有1％自体血浆的AIM-V培养基。


2.一种成熟DC培养方法，其特征在于，所述培养方法包括如下步骤：
(1)获取PBMC；
(2)将PBMC诱导成不成熟DC，并活化不成熟DC；
(3)将活化后的不成熟DC负载抗原和ICOS抗体；
(4)利用权利要求1所述的成熟DC诱导剂将步骤3获得的不成熟DC诱导成成熟DC。


3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，步骤1的具体操作如下：
单采机采外周血，75％酒精擦拭采血袋，放入生物安全柜内；
将血转移入50mL离心管中，2200rpm离心10min，吸走血浆，加入PBS至原体积，将稀释后血液按体积比1:1缓缓加入到提前准备好的ficoll分离液上方，轻拿轻放不破坏上下层液面；
离心机参数设置为升9降6，2000rpm，15min；
离心完成后轻轻吸取白膜层，PBS离心清洗3次。


4.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，步骤2的具体操作如下：
a、培养瓶包被权利要求1所述的不成熟DC活化剂；
b、将PBMC接种到经步骤a处理的培养瓶中，加入权利要求1所述的不成熟DC诱导剂培养。


5.根据权利要求4所述的培养方法，其特征在于，步...

【专利技术属性】
技术研发人员：马艳玲，李欢欢，程旭东，
申请(专利权)人：中生康元生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11