一种用于鉴定肿瘤新抗原的细菌表达载体及筛选鉴定肿瘤新抗原的方法技术

本发明专利技术公开了一种用于鉴定肿瘤新抗原的细菌表达载体及筛选鉴定肿瘤新抗原的方法，涉及肿瘤检测技术领域。表达载体可以稳定表达肿瘤新抗原，包括多个具有特殊功能的插入基因片段，插入基因片段包括能够有效提高肿瘤抗原递呈效率的第一基因片段和有效提高克隆效率的第二基因片段。还提供了一种通量进行肿瘤新抗原免疫学功能验证进而快速有效的筛选肿瘤新抗原的方法。

A bacterial expression vector for the identification of new tumor antigens and a method for the screening and identification of new tumor antigens

The invention discloses a bacterial expression vector for identifying a new tumor antigen and a method for screening and identifying a new tumor antigen, which relates to the technical field of tumor detection. The expression vector can stably express new tumor antigens, including multiple inserted gene fragments with special functions. The inserted gene fragments include the first gene fragment which can effectively improve the efficiency of tumor antigen presentation and the second gene fragment which can effectively improve the efficiency of cloning. It also provides a rapid and effective method to screen new tumor antigens by using the flux to verify the immunological function of new tumor antigens.

【技术实现步骤摘要】
一种用于鉴定肿瘤新抗原的细菌表达载体及筛选鉴定肿瘤新抗原的方法
本专利技术涉及肿瘤检测
，具体而言，涉及一种用于鉴定肿瘤新抗原的细菌表达载体及筛选鉴定肿瘤新抗原的方法。
技术介绍
目前，癌症已经是仅次于心脑血管疾病的人类第二大死因，其发病率和死亡率逐渐增加，为人们健康福利和社会经济发展带来了严重的负担。所有的癌症的发病机制都来自癌细胞的基因组DNA序列发生改变所导致的基因突变或染色体变异(Stratton,M.R.,2009)，所以在治疗癌症上存在一定的难度。治疗癌症的手段主要涉及了手术、放疗、化疗、内分泌治疗及生物治疗等，其中手术切除治疗的复发率高，而且有些癌症如白血病是不能采用手术治疗；而化疗存在严重的副作用和产生药物抗性。免疫治疗法现成为一种有吸引力和前景的癌症治疗方法，主要有三种类型：免疫检查点抑制剂(immunecheckpointblockade)、过继性细胞治疗(adoptivecelltherapy)、肿瘤疫苗(cancervaccine)。免疫检查点抑制剂就是采用人类单克隆抗体中和免疫检查点抑制子，如细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)，程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)和它的配体PDL1，其机制抑制这些蛋白可以提高对肿瘤的T细胞调节的免疫反应但是只有少部分患者能够对这种疗法具有响应，而且会产生免疫相关不良事件。过继性细胞治疗如嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)在临床上尤其血液类癌症取得了显著的临床效果，所以美国食品与药物安全局审批通过针对急性淋巴细胞白血病的B细胞抗CD19的CAR-T细胞疗法，尽管该方法在实体瘤由于缺乏表面抗原(Klebanoff，2016)，难以入侵实体瘤和抑制免疫反应的肿瘤微环境仍处于探索阶段；所用的抗原在肿瘤细胞中高表达，而在正常细胞中和特定组织器官或多或少有低表达，这将导致严重的靶向、非肿瘤毒性，但该疗法的关注度日益上升和将成为具有前景的一种肿瘤疗法。肿瘤疫苗(cancervaccine)采用肿瘤特异性抗原刺激肿瘤细胞免疫反应。在肿瘤细胞中存在两种肿瘤抗原：肿瘤相关抗原(tumorassociatedantigens，TAAs)和肿瘤特异性抗原(tumorspecificantigens)。肿瘤相关抗原是指在肿瘤细胞中过度表达的蛋白，而在正常细胞中也有表达，例如肿瘤高表达的表皮细胞生长因子HER2、端粒酶逆转录酶TERT等，但是，这些抗原存在一定程度的中枢耐受与缺乏完全特异性，同样可能产生靶向、非肿瘤毒性的危险。肿瘤特异性抗原是指只在肿瘤细胞特异，在正常细胞没有表达的一类蛋白，其中包括致癌病毒抗原(Oncogenicviralantigens)和新抗原(neoantigens)。致癌病毒抗原是有病毒DNA插入基因组而产生的肿瘤。新抗原是由体细胞DNA产生突变的表达产物，具有高度肿瘤特异的和易于引起免疫反应，不会产生靶向、非肿瘤毒性。通常，如果这些异常蛋白在细胞内(肿瘤细胞或APCs)被降解成具有抗原表位的短肽段，短肽段与MHC-I类或MHC-II类分子高亲和力结合，并以复合物形式呈递到细胞表面，被T细胞识别，引起T细胞活化，进而肿瘤细胞被效应T细胞攻击和清除。如何鉴定和验证肿瘤新抗原的有效性仍为待解决的难题。鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于鉴定肿瘤新抗原的细菌表达载体。该细菌表达载体可以稳定表达肿瘤新抗原，提升克隆效率，提高肿瘤新抗原递呈效率。本专利技术的另一目的在于提供一种筛选鉴定肿瘤新抗原的方法。该方法通过构建能够稳定表达候选肿瘤新抗原，并促进抗原递呈细胞递呈抗原效率的载体，实现在体外快速有效的鉴定有免疫学功能的肿瘤新抗原。本专利技术是这样实现的：一种用于鉴定肿瘤新抗原的细菌表达载体，载体上包括多个插入基因片段，多个插入基因包括第一基因hly片段和第二基因ccdB片段；第一基因hly片段编码的蛋白序列如SEQIDNO.1所示，第二基因ccdB片段编码的蛋白的序列如SEQIDNO.2所示；优选地，第一基因hly片段的核酸序列如SEQIDNO.3所示；优选地，第二基因ccdB片段的核酸序列如SEQIDNO.4所示。进一步，第一基因为hly基因，hly基因从李斯特菌种中克隆而来，或者采用基因合成的方法直接合成获得，其能够显著增加MHCI型肿瘤抗原呈递效率。原理是：hly基因可以表达李斯特菌溶血素蛋白(LLO)，抗原递呈细胞吞噬表达hly基因的细菌后，溶血素蛋白进入抗原递呈细胞内，破坏抗原递呈细胞的溶酶体膜，帮助溶酶体内的抗原肽逃逸，离开溶酶体的抗原肽散布到细胞质中，进而进入MHCI型抗原递呈系统，实现抗原递呈。第二基因为ccdB基因，ccdB基因编码细菌毒性蛋白CcdB，CcdB蛋白能使DNA促旋酶复合体中毒，并抑制促旋酶的活性，从而抑制DNA复制，使细胞中毒。本专利技术将ccdB基因构建到表达载体上作为质粒转化时的选择标记，在载体的两个重组位点序列间添加ccdB基因，ccdB基因的表达产物能抑制普通大肠杆菌的生长，在克隆时没有切开或者自身环化的载体在转化后不能生长，而插入基因(重组片段)重组后的载体在转化后能够生长，从而极大提升了克隆效率。在本专利技术应用较佳的实施例中，上述载体为ZS91载体。ZS91载体以T7启动子为系统，该系统可以使几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白，此外可以通过控制诱导条件控制T7RNA聚合酶的量，从而控制产物的表达量。载体的核酸序列如SEQIDNO.5所示。该载体包括第一基因hly片段和第二基因ccdB片段。一种筛选鉴定肿瘤新抗原的方法，其包括在载体上设计Nde1-Kpn1两个酶切位点，将待鉴定的候选肿瘤新抗原的DNA序列插入其间。进一步地，hly基因片段从李斯特菌种中克隆而来，或者采用基因合成的方法直接合成获得。克隆hly基因片段的方法包括PCR方法获得hly片段，再将克隆出的hly基因连接至中间载体，再通过酶切连接到ZS91载体中。在本专利技术应用较佳的实施例中，上述构建细菌表达载体还包括在细菌表达载体的Nde1-Kpn1两个酶切位点间且位于第二基因后插入OVA抗原(卵清蛋白)片段序列，将插入OVA片段后的载体转化细菌细胞，诱导表达，将诱导的细菌转化小鼠抗原递呈细胞后与T淋巴细胞共培养，检测OVA的细菌递呈效率；优选地，OVA抗原序列为OVA21-388或者3×OVA8；OVA21-388的DNA序列如SEQIDNO.6所示，3×OVA8的DNA序列如SEQIDNO.7所示；OVA21-388的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示，3×OVA8的氨基酸序列如SEQIDNO.9所示；优选地，小鼠抗原递呈细胞为小鼠杂交瘤细胞DC2.4，T淋巴细胞为小鼠杂交瘤细胞B3Z细胞；优选地，采用ELISA方法检测B3Z细胞中细胞分子的分泌，采用Elispot检测B3Z细胞分子的分泌；优选地，采用ELISA方法检测B3Z细胞中IL-2的分泌，采用Elispot检测B3Z细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于鉴定肿瘤新抗原的细菌表达载体，其特征在于，所述载体上包括多个插入基因片段，多个所述插入基因包括第一基因hly片段和第二基因ccdB片段；所述第一基因hly片段编码的蛋白序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二基因ccdB片段编码的蛋白的序列如SEQ ID NO.2所示；/n优选地，所述第一基因hly片段的核酸序列如SEQ ID NO.3所示；/n优选地，所述第二基因ccdB片段的核酸序列如SEQ ID NO.4所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴定肿瘤新抗原的细菌表达载体，其特征在于，所述载体上包括多个插入基因片段，多个所述插入基因包括第一基因hly片段和第二基因ccdB片段；所述第一基因hly片段编码的蛋白序列如SEQIDNO.1所示，所述第二基因ccdB片段编码的蛋白的序列如SEQIDNO.2所示；
优选地，所述第一基因hly片段的核酸序列如SEQIDNO.3所示；
优选地，所述第二基因ccdB片段的核酸序列如SEQIDNO.4所示。


2.根据权利要求1所述的细菌表达载体，其特征在于，所述载体的核酸序列如SEQIDNO.5所示。


3.一种筛选鉴定肿瘤新抗原的方法，其特征在于，其包括在权利要求2所述的载体上设计Nde1-Kpn1两个酶切位点，将待鉴定的候选肿瘤新抗原的DNA序列插入Nde1-Kpn1两个酶切位点之间。


4.根据权利要求3所述的筛选鉴定肿瘤新抗原的方法，其特征在于，构建细菌表达载体还包括在细菌表达载体的Nde1-Kpn1两个酶切位点间插入OVA抗原序列，将插入OVA抗原序列后的载体转化细菌细胞，诱导表达，将诱导的细菌转化小鼠抗原递呈细胞并和T淋巴细胞共培养，检测OVA的递呈效率；
优选地，所述OVA抗原序列为OVA21-388或者3×OVA8；所述OVA21-388的DNA序列如SEQIDNO.6所示，所述3×OVA8的DNA序列如SEQIDNO.7所示；所述OVA21-388的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示，所述3×OVA8的氨基酸序列如SEQIDNO.9所示；
优选地，所述小鼠抗原递呈细胞为小鼠杂交瘤细胞系DC2.4，小鼠T淋巴细胞为小鼠杂交瘤细胞系B3Z；
优选地，采用ELISA方法检测B3Z细胞中IL-2的分泌，采用Elispot检测B3Z细胞中IFN-γ的分泌。


5.根据权利要求3所述的筛选鉴定肿瘤新抗原的方法，其特征在于，构建细菌表达载体还包括在将细菌表达载体用Nde1-Kpn1酶切后插入32个来源于CEF的抗原序列，将插入CEF抗原序列后的载体转入细菌中并诱导表达，将诱导的细菌转化人的抗原递呈细胞后与T淋巴细胞共培养，检测抗原递呈效率；
优选地，采用ELISA方法检测T淋巴细胞中IL-2的分泌，采用Elispot检测T淋巴细胞中IFN-γ的分泌；
优选地，所述CEF为CMV，EBV和Influenza。


6.根据权利要求3所述的筛选鉴定肿瘤新抗原的方法，其特征在于，所述方法还包括人工合成候选肿瘤新抗原的DNA序列，插入细菌表达载体上的Nde1-Kpn1酶切位点间，在细菌中诱导表达候选肿瘤新抗原；
优选地，诱导表达候选肿瘤新抗原的细菌为BL21。


7.根据权利要求6所述的筛选鉴定肿瘤新抗原的方法，其特征在于，在合成所述候选肿瘤新抗原的DNA序列之前还包括进行候选肿瘤新抗原的DNA序列预测，预测候选肿瘤新抗原的DNA序列包括对肿瘤样本或组织进行全外显子测序和RNA测序，鉴定突变的位点和突变基因的表达，利用生物信息方法筛选出突变的肽段与患者的HLA分子结合能力最强的多种肽段作为候选肿瘤新抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：程旭东，
申请(专利权)人：中生康元生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11