金属硫蛋白表达载体及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种金属硫蛋白表达载体及其应用，所述金属硫蛋白表达载体包括由金属硫蛋白的编码序列作为目标蛋白插入类伴侣样蛋白的下游所形成的融合蛋白表达载体，其中，所述类伴侣样蛋白为序列如SEQ ID NO：1～3任一所示的链球菌蛋白G的B结构域PGB。本发明专利技术构建的金属硫蛋白表达载体，能够促进金属硫蛋白的表达并提高表达量，且经由该融合蛋白表达载体所表达的PGB‑MT融合蛋白在His‑Tag‑镍柱分离纯化后，能够被Fax酶切水解，并进一步通过常规方法纯化MT，为MT蛋白的科学研究和工业化生产提供了新技术。

Metallothionein expression vector and its application

The invention discloses a metallothionein expression vector and its application. The metallothionein expression vector comprises a fusion protein expression vector formed by taking the coding sequence of metallothionein as the downstream of the target protein inserted into the chaperone like protein, wherein the chaperone like egg white is the B domain PGB of Streptococcus protein G as shown in any sequence of SEQ ID No: 1-3. The metallothionein expression vector constructed by the invention can promote the expression of metallothionein and increase the expression amount, and the PGB \u2011 MT fusion protein expressed by the fusion protein expression vector can be hydrolyzed by fax enzyme after separation and purification on his \u2011 tag \u2011 nickel column, and further purified MT by conventional methods, which provides a new technology for scientific research and industrial production of MT protein.

【技术实现步骤摘要】
金属硫蛋白表达载体及其应用
本专利技术涉及基因工程和蛋白质表达
，特别涉及重组人碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白构建
，具体涉及一种金属硫蛋白表达载体及其应用。
技术介绍
金属硫蛋白(Metallothionein，MT)具有多种强大的生理功能，给其在治疗学上的应用提供了坚实基础。同时，MT也是进化上非常古老和保守的小分子蛋白性生物保护剂，从微生物到灵长类，都有自己的MT，这是因为重金属铅汞镉、自由基对所有动物、微生物的组织结构和机能都有伤害作用。其中，MT在人体医学中的应用体现在以下方面：1、有害重金属解毒作用：皮肤是人体最大的器官，外界灰尘和皮肤污染物中(如含铅化妆品)的有害重金属较多，常常来自矿山粉尘、污染的公路或土地扬起的灰尘、含铅燃油的排烟、污染汽油车的尾气、污染的水源等等。人类皮肤具有微量吸收和累积能力，通过接触而被吸收，MT具有结合有害重金属，阻止有害重金属进入细胞影响细胞代谢机能，被MT结合包裹后的有害重金属不显示毒性。2、MT的抗氧化作用：皮肤是人体的暴露器官，各种辐射(如太阳光的紫外等)首先作用于皮肤，导致皮肤和皮下的水分子发生电离效应，产生自由基；自由基是一种强氧化物，能使细胞膜通透性增加、细胞的酶和蛋白质氧化失活、DNA突变等，导致细胞代谢障碍、细胞衰老加速、细胞提早老化凋亡。同时使得皮肤的胶原蛋白(胶原纤维)、弹性蛋白(弹性纤维)氧化(即老化)而失去弹性，使得皮肤松弛，失去弹性，产生大量皱纹。因为MT主要集中在皮肤中，所以在护肤、延缓衰老、缓解皮肤过敏的抗衰美容日化产品中有重要用途。除此之外，MT抗氧化保护细胞的作用还可用在：①抗衰老、防癌：通过刺激机体淋巴细胞释放淋巴因子，激活免疫细胞活性，达到或恢复正常免疫监视功能，从而起到防癌作用，例如美国人将兔肝MT做成膳食补充剂。②癌症放化疗的辅助治疗手段：放射线和某些化疗药都能加速自由基的产生，MT可以中和自由基(提供电子，而本身不抢夺电子)，从而减轻放化疗不良反应。③防止动脉粥样硬化：MT通过减少脂质过氧化物，阻碍氧化脂质对血管内皮细胞的损伤。④减轻和预防吸烟对人体的危害：吸烟会产生大量自由基，MT能中和自由基。⑤阻止或减少皮肤脂褐素和腊样质的产生：脂褐素和腊样质可致皮肤色斑和粗糙，自由基对这两类粘稠状物质形成起着至关重要的作用，在自由基与过氧化酶作用下，脂质形成脂质过氧化物，后者与某些蛋白质和磷脂聚合交联而形成脂褐素和腊样质。3、参与微量元素补充、储存、运输和代谢，如锌、铜等，1分子MT与5～7个锌离子结合并被吸收，可预防机体由缺锌导致的对机体的不良影响。4、辅助治疗糖尿病、冠心病、消化道溃疡、风湿及类风湿关节炎，防治老年性痴呆、皮肤过敏症等疾病。其次，MT也可以应用于动物饲料中，例如饲料中添加清洁MT，可以帮助饲养低有害重金属含量的家畜、家禽，同时还可以提高养殖动物的免疫力，减少疫病发生。因此MT对肉食食品或禽蛋供应市场，也存在巨大的需求潜力。此外，MT在植物抗逆性中也有应用，例如，植物金属硫蛋白在植物体内转运重金属并解除其毒性，转运必需微量金属作为金属供体，调节微量必需金属的体内稳态或金属库，还参与植物的多种胁迫抗性的形成和活性氧清除，对调节植物胞内氧化还原状态起到信号的作用；植物金属硫蛋白还受植物激素的调控，在植物的形态构建中发挥重要作用。因此植物金属硫蛋白是植物抗逆过程中的重要信号，具有重要的生理功能。所以，有望开发出植物生物刺激素或页面肥，用于植物抗病害能力提升，提高植物产量。MT又称巯基金属结合蛋白，是一类非酶蛋白质，除含有镉(Cd)、锌(Zn)的MT外，在自然界也存在含有铜(Cu)、汞(Hz)、金(Au)、铋(Bi)等元素的MT。MT的蛋白质分子内不含有芳香族氨基酸和组氨酸。让MT中50％的金属离子发生解离的pH值分别为：Zn-MT：3.5～4.5；Cd-MT：2.5～3.5；Cu-MT<1.0。因MT缺乏芳香族氨基酸，故在280nm处无吸收峰，而具有与金属相关的吸收峰，去金属的MT在190nm处有一个吸收峰。无论是自然产生还是诱导产生的MT，其氨基酸组成基本相同，主要不同在所含金属及其含量。目前MT产品主要从兔肝、马肾、猪肝和微生物(如粗脉孢菌)等中提取。关于MT的功能和开发利用，自1978年到1999年先后在瑞士、日本、美国共举行了四次国际专题研讨会，第五次国际专题研讨会于2005年10月在北京召开。1987年我国将MT列入[863]计划，“八五”、“九五”重大攻关项目，1994年列入国家级“火炬计划”；2003年MT项目被国家科技部列为“国家科技成果重点推广计划项目,1995年联合国将MT列入向世界各国推荐的21世纪生物技术产品。由此可见国内外对MT的研究、开发、推广、应用都给予了高度重视。MT的发现和研究超过半个世纪，适于上世纪60年代。尽管MT的需求量很大，尤其人类MT，有可能发展到人类同源蛋白制药。然而，目前的工业化生产技术仍然没有得到广泛突破。MT的动物源性提取，依旧占据原料来源主要市场。然而，动物保护和动物疫病的传播(如疯牛病、动物病毒病等)，使得各国都很谨慎使用和控制国外进口。在非控制饲养的方便来源的动物肝肾中提取MT，不仅产量低，而存在有害重金属携带可能。关于MT的生物发酵生产方面，国内外曾报道用枯草杆菌、链球菌、酵母菌等菌种采取高重金属胁迫适应筛选菌株方法生产，上世纪也曾报道基因工程重组载体导入宿主大肠杆菌、酵母菌诱导发酵生产，但效果不尽人意，主要是MT产量过低或重金属污染而未能投入工业化发酵提取。近年来，有国内专利报道了小泛素修饰蛋白(SUMO)融合蛋白载体大肠杆菌表达MT1，但实际应用时产量仍然不高；国内盘古基因生物工程有专利报道采用人类游离脂肪酸结合蛋白(hFABP)融合蛋白载体大肠杆菌发酵生产MT1～4，在小试过程中提高了MT产量，但仍然存在放大生产后分离工艺引起的效率和产量问题。这是由于hMT(人金属硫蛋白)分子内有20个半胱氨酸(Cystine)，占据近1/3的hMT氨基酸构成，却没有分子内二硫键，酸变性后，自复性能力很强，而过多的半胱氨酸游离[-SH]容易还原聚集，造成分子悬浮不稳定，蛋白丢失，只有解决了这个问题，提高产量的效率才能体现出来。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提出一种金属硫蛋白表达载体及其应用，旨在提高金属硫蛋白的可溶性表达。为实现上述目的，本专利技术提出一种金属硫蛋白表达载体，包括由金属硫蛋白的编码序列作为目标蛋白插入类伴侣样蛋白的下游所形成的融合蛋白表达载体，其中，所述类伴侣样蛋白为序列如SEQIDNO：1～3任一所示的链球菌蛋白G的B结构域PGB。可选地，所述金属硫蛋白为金属硫蛋白-1、金属硫蛋白-2、金属硫蛋白-3或金属硫蛋白-4。可选地，所述金属硫蛋白-1包括金属硫蛋白-1A、金属硫蛋白-1B、金属硫蛋白-1E、金属硫蛋白-1F、金属硫蛋白-1G、金属硫蛋白-1H、金属硫蛋白-1M、金属硫蛋白-1R和金属硫蛋白-1X中的任意一种；和/或，由所述金属硫蛋白-1的编本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种金属硫蛋白表达载体，其特征在于，包括由金属硫蛋白的编码序列作为目标蛋白插入类伴侣样蛋白的下游所形成的融合蛋白表达载体，其中，所述类伴侣样蛋白为序列如SEQ ID NO：1～3任一所示的链球菌蛋白G的B结构域PGB。/n

【技术特征摘要】
1.一种金属硫蛋白表达载体，其特征在于，包括由金属硫蛋白的编码序列作为目标蛋白插入类伴侣样蛋白的下游所形成的融合蛋白表达载体，其中，所述类伴侣样蛋白为序列如SEQIDNO：1～3任一所示的链球菌蛋白G的B结构域PGB。


2.如权利要求1所述的金属硫蛋白表达载体，其特征在于，所述金属硫蛋白为金属硫蛋白-1、金属硫蛋白-2、金属硫蛋白-3或金属硫蛋白-4。


3.如权利要求2所述的金属硫蛋白表达载体，其特征在于，所述金属硫蛋白-1包括金属硫蛋白-1A、金属硫蛋白-1B、金属硫蛋白-1E、金属硫蛋白-1F、金属硫蛋白-1G、金属硫蛋白-1H、金属硫蛋白-1M、金属硫蛋白-1R和金属硫蛋白-1X中的任意一种；和/或，
由所述金属硫蛋白的编码序列所编码的金属硫蛋白的氨基酸序列与天然金属硫蛋白的氨基酸序列的同源性不低于80％。


4.如权利要求3所述的金属硫蛋白表达载体，其特征在于，所述金属硫蛋白-1为人金属硫蛋白-1F，所述人金属硫蛋白-1F的氨基酸编码序列如SEQIDNO：4所示；或者，
所述金属硫蛋白-2为人金属硫蛋白-2，所述人金属硫蛋白-2的氨基酸编码序列如SEQIDNO：5所示；或者，
所述金属硫蛋白-3为人金属硫蛋白-3，所述人金属硫蛋白-3的氨基酸编码序列如SEQIDNO：6所示；或者，
所述金属硫蛋白-4为人金属硫蛋白-4，所述人金属硫蛋白-4的氨基酸编码序列如SEQIDNO：7所示。


5.如权利要求1所述的金属硫蛋白表达载体，其特征在于，所述类伴侣样蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：李乾，
申请(专利权)人：因之彩生物科技武汉有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42