重组PLB-hEGF融合蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种重组PLB‑hEGF融合蛋白及其应用，所述重组PLB‑hEGF融合蛋白包括由蛋白L的B结构域与人表皮生长因子蛋白融合得到的融合蛋白，其中，所述蛋白L的B结构域包括如SEQ ID NO：1～5所示的PLB1～PLB5蛋白中的任意一个，所述人表皮生长因子蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。本发明专利技术提供的重组PLB‑hEGF融合蛋白，在构建成为融合蛋白表达载体用于表达hEGF时，提高了hEGF的可溶性表达，节省了体外复性的耗时工艺，且显著提高了比活性，对工业化生产可溶性、高比活性hEGF具有重要价值。

Recombinant PLB HGF fusion protein and its application

The invention discloses a recombinant PLB \u2011 HGF fusion protein and its application. The recombinant PLB \u2011 HGF fusion protein comprises a fusion protein obtained by fusing the B domain of protein L with the human epidermal growth factor protein, wherein the B domain of protein L comprises any one of the plb1-plb5 proteins as shown in SEQ ID No: 1-5, and the amino acid sequence of the human epidermal growth factor protein is as follows SEQ ID No: 8. The recombinant PLB \u2011 HGF fusion protein provided by the invention improves the soluble expression of HGF, saves the time-consuming process of in vitro renaturation, and significantly improves the specific activity when it is constructed as a fusion protein expression vector for expressing HGF, which is of great value for industrial production of soluble and high specific activity HGF.

【技术实现步骤摘要】
重组PLB-hEGF融合蛋白及其应用
本专利技术涉及基因工程和蛋白质工程
，特别涉及重组人表皮生长因子融合蛋白构建
，具体涉及一种重组PLB-hEGF融合蛋白及其应用。
技术介绍
蛋白L(ProteinL,PL)是1988年首次发现于大消化链球菌(Peptostreptococcusmagnus)细胞壁上的一种蛋白，随后分离鉴定，因为能与抗体的L链(轻链)结合而得名“ProteinL”。PL由719个氨基酸残基组成，分子量约为76kD，分子内不含任何二硫键，也不具有任何二硫键连接的亚基。它是一种酸性蛋白分子，等电点(pI)4.0。它不同于蛋白A(ProteinA)和蛋白G(ProteinG)，它不与抗体的Fc区域结合，而是结合抗体的Kappa型轻链(L)。PL基因包含5个编码成分：1个由18AA组成的信号肽，1个N-端79AA组成的“A”区，5个72～76AA同源重复的“B”区，1个C-端由2个52AA重复的“C”区。在C区之后有一段亲水性富含脯氨酸的“W”区，推测其为细菌细胞壁的“跨壁区”，最后一段为疏水性的“M”区，应当是细菌细胞膜的“锚定区”。表皮生长因子(EpidermalGrowthFactor,EGF)是一类广泛存在于人和动物体内的生长因子。EGF可以促进多种细胞生长的小分子促有丝分裂蛋白。其成熟肽含有53个氨基酸，分子量约6kD左右，含有3个二硫键，天然组织提取的EGF的生物活性高达1000万国际单位(IU)/mg以上，而国际国内的制药标准仅仅为≥50万IU/mg，是天然EGF比活性的1/20。可见其分子中3个二硫键的错配率可以高达95％(19/20)，这表明提高正确折叠率从而提高EGF比活性有很大的余地，对于节约EGF工艺成本、提高EGF的生物效应有着重要的医药工业价值。天然的人表皮生长因子(HumanEpidermalGrowthFactor,hEGF)比活性能达到1000万国际单位(IU)以上，而人类用于制药的标准仅仅是等于或大于50万IU，仅为天然EGF比活的1/20，可见重组hEGF比活性提升的空间仍然是巨大的。重组hEGF比活性的损失主要由于体外表达时的包涵体复性步骤。hEGF分子内有7个半胱氨酸残基，形成3对二硫键，维持EGF的3级结构稳定，构成与EGF受体密切结合的三位空间。包涵体表达时，需要用尿素或胍类离液盐溶解并变性EGF包涵体蛋白，然后体外复性，恢复EGF的3级结构(Re-folding)，得到可溶性EGF。这个复性过程是不完全的，且可能存在部分二硫键错配，因此使得即便复性可溶的EGF，常常比活性达不到50万IU，不能满足EGF制药原料的比活性要求。由于EGF具有广泛促进细胞生长的作用，从而也促进了其在创面修复和美容嫩肤领域的应用研究和需求，市场对EGF的需求不断增加，但是合格的EGF原料的价格仍然居高不下，因此提高EGF产量和比活性具有重要的工业价值。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提出一种重组PLB1-hEGF融合蛋白及其应用，旨在提高hEGF的可溶性表达。为实现上述目的，本专利技术提出一种重组PLB-hEGF融合蛋白，包括由蛋白L的B结构域(PLB)与人表皮生长因子(hEGF)蛋白融合得到的融合蛋白，其中，所述蛋白L的B结构域包括如SEQIDNO：1～5所示的PLB1～PLB5蛋白中的任意一个，所述人表皮生长因子蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：8所示。可选地，所述蛋白L的B结构域为如SEQIDNO：1所示的PLB1蛋白。可选地，所述PLB1蛋白的N端添加有翻译起始优化序列，而形成N端优化的PLB1蛋白，所述N端优化的PLB1蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：7所示。可选地，所述N端优化的PLB1蛋白的C端添加有柔性接头、蛋白酶识别区、优化的hEGF编码区和组氨酸标签，其中，所述柔性接头包括6～30个氨基酸；所述蛋白酶识别区包括凝血因子Xa蛋白酶识别区、凝血酶识别区、肠激酶识别区和TEV酶识别区中的任意一种；所述组氨酸标签包含5～9个His。可选地，所述柔性接头包括8～20个氨基酸；所述蛋白酶识别区为凝血因子Xa蛋白酶识别区；所述组氨酸标签包含6个His。可选地，所述柔性接头的序列如SEQIDNO：14,15所示；所述凝血因子Xa蛋白酶识别区的序列如SEQIDNO：16,17所示；所述组氨酸标签的序列如SEQIDNO：18,19所示。可选地，所述重组PLB1-hEGF融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：10所示。本专利技术还提出一种如上所述的重组PLB-hEGF融合蛋白的编码基因。可选地，所述重组PLB-hEGF融合蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO：11所示。本专利技术还进一步提出一种包含如上所述的重组PLB-hEGF融合蛋白的编码基因的重组PLB-hEGF融合蛋白表达载体或表达工程菌。可选地，所述重组PLB-hEGF融合蛋白表达载体是将上述重组PLB-hEGF融合蛋白的编码基因插入到原核细胞表达质粒的NcoI和XhoI酶切位点之间得到。可选地，所述原核细胞表达质粒选用pET28作为亲本表达载体。本专利技术还提出如上所述的重组PLB-hEGF融合蛋白表达载体在表达PLB-hEGF融合蛋白中的应用。本专利技术还提出一种重组PLB-hEGF融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：将如上所述的重组PLB-hEGF融合蛋白表达载体转化感受态表达菌株获得表达工程菌，然后对所述表达工程菌进行培养，获得重组PLB-hEGF融合蛋白。此外，本专利技术还提出一种重组PLB-hEGF融合蛋白表达工程菌的制备方法，包括以下步骤：基于多聚酶链式反应的全基因人工合成方法，合成PLB与hEGF的融合蛋白PLB-hEGF的DNA编码序列，其中，所述融合蛋白PLB-hEGF的序列如SEQIDNO：10所示，所述DNA编码序列如SEQIDNO：11所示；将所述融合蛋白PLB-hEGF的编码DNA经过NocI和XhoIDNA限制性内切酶消化和琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，得到插入片段；经过内切酶NocI和XhoI双酶切并琼脂糖凝胶电泳分离纯化原核细胞表达质粒，得到线性化空载体；用T4DNA连接酶将所述线性化空载体与所述融合蛋白PLB-hEGF的编码DNA片段相连接，然后转化感受态菌DH5α，经经阳性克隆扩增、质粒制备及DNA测序后，获得序列正确的工程质粒；将所述工程质粒转化BL21(DE3)感受态表达菌株，在卡那霉素存在下进行筛选与诱导表达测试，获得重组PLB-hEGF融合蛋白表达工程菌株。本专利技术提供的技术方案中，将蛋白L的B结构域与人表皮生长因子蛋白融合得到PLB-hEGF融合蛋白，使用该PLB-hEGF融合蛋白构建得到的融合蛋白表达载体表达hEGF时，提高了hEGF的可溶性表达，节省了体外复性的耗时工艺，且显著提高了比活性，对工业化生产可溶性、高比活性hEGF具有重要价值本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组PLB-hEGF融合蛋白，其特征在于，包括由蛋白L的B结构域与人表皮生长因子蛋白融合得到的融合蛋白，其中，所述蛋白L的B结构域包括如SEQ ID NO：1～5所示的PLB1～PLB5蛋白中的任意一个，所述人表皮生长因子蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组PLB-hEGF融合蛋白，其特征在于，包括由蛋白L的B结构域与人表皮生长因子蛋白融合得到的融合蛋白，其中，所述蛋白L的B结构域包括如SEQIDNO：1～5所示的PLB1～PLB5蛋白中的任意一个，所述人表皮生长因子蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：8所示。


2.如权利要求1所述的重组PLB-hEGF融合蛋白，其特征在于，所述蛋白L的B结构域为如SEQIDNO：1所示的PLB1蛋白。


3.如权利要求2所述的重组PLB-hEGF融合蛋白，其特征在于，所述PLB1蛋白的N端添加有翻译起始优化序列，而形成N端优化的PLB1蛋白，所述N端优化的PLB1蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：7所示。


4.如权利要求3所述的重组PLB-hEGF融合蛋白，其特征在于，所述N端优化的PLB1蛋白的C端添加有柔性接头、蛋白酶识别区、优化的hEGF编码区和组氨酸标签，其中，
所述柔性接头包括6～30个氨基酸；
所述蛋白酶识别区包括凝血因子Xa蛋白酶识别区、凝血酶识别区、肠激酶识别区和TEV酶识别区中的任意一种；
所述组氨酸标签包含5～9个His。


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【专利技术属性】
技术研发人员：李乾，
申请(专利权)人：因之彩生物科技武汉有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42