基于流感嗜血杆菌表面蛋白抗体的流感嗜血杆菌Elisa检测试剂盒及制备方法技术

本发明专利技术涉及一种快速检测流感嗜血杆菌的Elisa检测试剂盒及其制备方法。该试剂盒包含有：包被抗流感嗜血杆菌D15及Pe蛋白多克隆抗体的酶标板、抗流感嗜血杆菌Pcp及PilA蛋白多克隆抗体、流感嗜血杆菌阳性对照、阴性对照、洗涤液、酶标二抗、酶显色底物和终止液。本发明专利技术的试剂盒对流感嗜血杆菌四种特异性表面蛋白进行联合检测，大大提高了流感嗜血杆菌检测的灵敏度、特异性和可重复性，可用于对流感嗜血杆菌非诊断性检测及研究工作。

Detection kit and preparation method of Haemophilus influenzae ELISA based on the surface protein antibody of Haemophilus influenzae

The invention relates to an ELISA detection kit for rapid detection of Haemophilus influenzae and a preparation method thereof. The kit contains: enzyme plate coated with polyclonal antibodies against Haemophilus influenzae D15 and PE protein, polyclonal antibodies against Haemophilus influenzae PCP and pila protein, Haemophilus influenzae positive control, negative control, washing solution, enzyme BIAB, enzyme chromogenic substrate and termination solution. The kit can jointly detect four specific surface proteins of Haemophilus influenzae, greatly improving the sensitivity, specificity and repeatability of detection of Haemophilus influenzae, and can be used for non diagnostic detection and research work of Haemophilus influenzae.

【技术实现步骤摘要】
基于流感嗜血杆菌表面蛋白抗体的流感嗜血杆菌Elisa检测试剂盒及制备方法
本专利技术属于生物技术及传染病诊断研究领域，涉及一种Elisa检测试剂盒，尤其涉及一种基于流感嗜血杆菌表面蛋白抗体的流感嗜血杆菌Elisa检测试剂盒及制备方法。
技术介绍
流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae,Hi)是一种没有运动力的革兰氏阴性杆菌。它是于1892年由费佛博士在流行性感冒的瘟疫中发现。它一般都是好氧生物，但可以成长为兼性厌氧生物。流感嗜血杆菌最初被误认为是流行性感冒的病因，但直至1933年，当发现流行性感冒的病毒性病原后，才消除了这种误解。流感嗜血杆菌一般有六种菌株，称为a型、b型(又称乙型)、c型、d型、e型及f型。由流感嗜血杆菌自然产生的疾病只会在人类出现。在婴儿及孩童中，乙型流感嗜血杆菌会引致菌血病症及急性细菌性脑膜炎。偶尔地它会引致蜂窝组织炎、骨髓炎及关节感染。自从1990年开始，美国使用HiB结合型疫苗后，HiB病症的患病率减少至每十万名儿童有1.3名儿童感染。但是，HiB仍然是发展中国家引致婴儿及儿童下呼吸道疾病的主因。没有荚膜的流感嗜血杆菌会引致儿童的耳朵感染(如中耳炎)、眼睛感染(结膜炎)及鼻窦炎，并且联带肺炎。此种细菌对培养的营养需要较为严格且往往寄生在上气道内，因此培养常出现假阴性和假阳性。目前检测呼吸道中该病原体的方法主要以传统方法为主，即分离鉴定法，该方法所需时间长，一般要2-3天，很难满足快速鉴定的需要；近几年发展起来的PCR技术，是一种快速、灵敏、特异性好的技术，但是目前该技术还是依赖于传统方法的前增菌步骤，而增菌液中往往还有PCR抑制剂，从而影响扩增的效果。同时，该技术还需要专业的检测设备，不适合进行床旁检测。此外，由于此项技术过于灵敏，经常会造成假阳性。以抗体为基础的免疫学检测已成为人体病原微生物检测不可或缺的重要技术手段。目前已发展了多种特异性免疫检测技术，如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)、荧光免疫分析(FIA)、化学发光免疫分析(CIA)、免疫沉淀反应、免疫凝集反应、ELISA检测试剂盒、免疫胶体金试纸条、免疫乳胶检测试剂等。其中ELISA等多种以抗体为基础的免疫学检测技术，以其简便、快速、灵敏、准确、实用的特点已成为病原微生物检测不可或缺的重要手段。因而，研究开发具有自主知识产权的病原微生物的抗体，是开发拥有自主知识产权的ELISA检测方法的基础。抗原成分的选择是制备高特异性抗体的关键。流感嗜血杆菌Pe、D15、PCP及PilA蛋白均是位于细胞表面的重要分子，其保守性高，特异性强，抗原性强，表面暴露性高，是较为理想的检测标的物。本研究选用具有种间特异性的表面蛋白Pe、D15、PCP及PilA等作为检测标的物，通过基因重组的方式制备重组抗原，进而制备特异性良好的多克隆抗体，并将其应用于制备流感嗜血杆菌Elisa检测试剂盒。
技术实现思路
为了解决
技术介绍
中存在的上述技术问题，本专利技术提供了一种可提高流感嗜血杆菌检测的灵敏度、特异性及可重复性强、操作简单、成本低廉以及快捷迅速地对流感嗜血杆菌进行检测的基于流感嗜血杆菌表面蛋白抗体的流感嗜血杆菌Elisa检测试剂盒及制备方法。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种基于流感嗜血杆菌表面蛋白抗体的流感嗜血杆菌Elisa检测试剂盒，其特征在于：所述基于流感嗜血杆菌表面蛋白抗体的流感嗜血杆菌Elisa检测试剂盒包括包被抗流感嗜血杆菌表面蛋白(D15及Pe)的多克隆抗体的酶标板、抗流感嗜血杆菌表面蛋白(Pcp及PilA)多克隆抗体、流感嗜血杆菌阳性对照、阴性对照、洗涤液、酶标二抗、酶显色底物以及终止液；所述流感嗜血杆菌阳性对照是灭活的流感嗜血杆菌菌液；所述阴性对照是灭活的大肠杆菌菌液；所述洗涤液的组分及含量是：磷酸氢二钠1.4g/L，磷酸二氢钠0.2g/L，氯化钠8.5g/L，Tween-200.5mL/L，所述洗涤液的pH＝7.4；所述酶标二抗是辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG；所述酶显色底物是TMB显色液；所述终止液是1MHCL溶液。一种基于流感嗜血杆菌表面蛋白抗体的流感嗜血杆菌Elisa检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述基于流感嗜血杆菌表面蛋白抗体的流感嗜血杆菌Elisa检测试剂盒包括包被抗流感嗜血杆菌表面蛋白(D15及Pe)的多克隆抗体的酶标板、抗流感嗜血杆菌表面蛋白(Pcp及PilA)多克隆抗体、流感嗜血杆菌阳性对照、阴性对照、洗涤液、酶标二抗、酶显色底物以及终止液；所述流感嗜血杆菌阳性对照是灭活的流感嗜血杆菌菌液；所述阴性对照是灭活的大肠杆菌菌液；所述洗涤液的组分及含量是：磷酸氢二钠1.4g/L，磷酸二氢钠0.2g/L，氯化钠8.5g/L，Tween-200.5mL/L，所述洗涤液的pH＝7.4；所述酶标二抗是辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG；所述酶显色底物是TMB显色液；所述终止液是1MHCL溶液；所述包被抗流感嗜血杆菌表面蛋白(D15及Pe)的多克隆抗体的酶标板的制备方法是：1)抗流感嗜血杆菌表面蛋白(D15及Pe)多克隆抗体的制备：1.1)分别获取流感嗜血杆菌表面蛋白D15及表面蛋白Pe胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段并找到该肽段基因编码序列，优化肽段基因编码序列，并将优化后的肽段基因编码序列用柔性连接肽的编码序列进行连接，形成融合基因；所述流感嗜血杆菌表面蛋白D15及表面蛋白Pe在NCBI蛋白质数据库中的accessionnumber分别为AAX87955及AGT37361；所述柔性连接肽的序列是ggsggsggsggs；同时在该融合基因的5’引入酶切位点NdeI、3’端引入终止信号TAA和酶切位点BamHI后化学合成全基因序列，记为D15pe；所述D15pe的基因全序列是：CATATGCAGCGCGTAACCGACAACGACGTTGCAAACATCGTACGTTCTCTGTTTGTGTCCGGCCGTTTCGATGACGTTAAAGCTCACCAGGAAGGTGATGTTCTGGTTGTTTCTGTTGTTGCAAAATCCATCATCAGTGACGTTAAAATCAAGGGCAACTCTATCATCCCAACTGAAGCTCTGAAGCAGAACCTGGACGCTAACGGTTTTAAAGTAGGTGATGTTCTGATCCGTGAAAAGCTGAACGAATTCGCTAAATCCGTTAAGGAGCATTATGCGAGTGTTGGTCGTTACAACGCTACCGTAGAACCGATTGTTAACACTCTGCCGAACAACCGCGCGGAAATCCTGATCCAGATCAACGAAGATGATAAAGCAAAACTGGCTTCTCTGACCTTCAAAGGTAACGAATCTGTATCCTCATCCACTCTTCAGGAACAGATGGAACTGCAGCCGGACTCTTGGTGGAAGCTGTGGGGCAACAAATTCGAAGGCGCGCAGTTCGAAAAAGACCTGCAATCTATTCGTGATTAT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种流感嗜血杆菌表面蛋白(D15及Pe)，其特征在于：所述流感嗜血杆菌表面蛋白(D15及Pe)的蛋白质序列是：/nMQRVTDNDVANIVRSLFVSGRFDDVKAHQEGDVLVVSVVAKSIISDVKIKGNSIIPTEALKQNLDANGFKVGDVLIREKLNEFAKSVKEHYASVGRYNATVEPIVNTLPNNRAEILIQINEDDKAKLASLTFKGNESVSSSTLQEQMELQPDSWWKLWGNKFEGAQFEKDLQSIRDYYLNNGYAKGGSGGSGGSGGSLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQKKH；/n用于编码所述流感嗜血杆菌表面蛋白(D15及Pe)的蛋白质的基因全序列是：/nCATATGCAGCGCGTAACCGACAACGACGTTGCAAACATCGTACGTTCTCTGTTTGTGTCCGGCCGTTTCGATGACGTTAAAGCTCACCAGGAAGGTGATGTTCTGGTTGTTTCTGTTGTTGCAAAATCCATCATCAGTGACGTTAAAATCAAGGGCAACTCTATCATCCCAACTGAAGCTCTGAAGCAGAACCTGGACGCTAACGGTTTTAAAGTAGGTGATGTTCTGATCCGTGAAAAGCTGAACGAATTCGCTAAATCCGTTAAGGAGCATTATGCGAGTGTTGGTCGTTACAACGCTACCGTAGAACCGATTGTTAACACTCTGCCGAACAACCGCGCGGAAATCCTGATCCAGATCAACGAAGATGATAAAGCAAAACTGGCTTCTCTGACCTTCAAAGGTAACGAATCTGTATCCTCATCCACTCTTCAGGAACAGATGGAACTGCAGCCGGACTCTTGGTGGAAGCTGTGGGGCAACAAATTCGAAGGCGCGCAGTTCGAAAAAGACCTGCAATCTATTCGTGATTATTACCTGAACAACGGTTATGCAAAAGGTGGTTCTGGTGGTTCTGGTGGTTCTGGTGGTTCTCTGGTAAAAAACGTTAACTACTACATCGACTCTGAATCCATCTGGGTTGATAACCAGGAACCACAGATCGTACACTTCGACGCTGTTGTTAACCTCGATAAAGGCCTGTACGTTTACCCGGAACCAAAGCGTTACGCTCGTTCTGTTCGTCAGTACAAAATCCTTAACTGTGCGAACTACCATCTGACCCAGGTACGTACCGACTTTTACGACGAATTCTGGGGTCAGGGCCTGCGCGCAGCTCCGAAAAAACAGAAAAAACACTAAGGATCC。/n...

【技术特征摘要】
1.一种流感嗜血杆菌表面蛋白(D15及Pe)，其特征在于：所述流感嗜血杆菌表面蛋白(D15及Pe)的蛋白质序列是：
MQRVTDNDVANIVRSLFVSGRFDDVKAHQEGDVLVVSVVAKSIISDVKIKGNSIIPTEALKQNLDANGFKVGDVLIREKLNEFAKSVKEHYASVGRYNATVEPIVNTLPNNRAEILIQINEDDKAKLASLTFKGNESVSSSTLQEQMELQPDSWWKLWGNKFEGAQFEKDLQSIRDYYLNNGYAKGGSGGSGGSGGSLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQKKH；
用于编码所述流感嗜血杆菌表面蛋白(D15及Pe)的蛋白质的基因全序列是：
CATATGCAGCGCGTAACCGACAACGACGTTGCAAACATCGTACGTTCTCTGTTTGTGTCCGGCCGTTTCGATGACGTTAAAGCTCACCAGGAAGGTGATGTTCTGGTTGTTTCTGTTGTTGCAAAATCCATCATCAGTGACGTTAAAATCAAGGGCAACTCTATCATCCCAACTGAAGCTCTGAAGCAGAACCTGGACGCTAACGGTTTTAAAGTAGGTGATGTTCTGATCCGTGAAAAGCTGAACGAATTCGCTAAATCCGTTAAGGAGCATTATGCGAGTGTTGGTCGTTACAACGCTACCGTAGAACCGATTGTTAACACTCTGCCGAACAACCGCGCGGAAATCCTGATCCAGATCAACGAAGATGATAAAGCAAAACTGGCTTCTCTGACCTTCAAAGGTAACGAATCTGTATCCTCATCCACTCTTCAGGAACAGATGGAACTGCAGCCGGACTCTTGGTGGAAGCTGTGGGGCAACAAATTCGAAGGCGCGCAGTTCGAAAAAGACCTGCAATCTATTCGTGATTATTACCTGAACAACGGTTATGCAAAAGGTGGTTCTGGTGGTTCTGGTGGTTCTGGTGGTTCTCTGGTAAAAAACGTTAACTACTACATCGACTCTGAATCCATCTGGGTTGATAACCAGGAACCACAGATCGTACACTTCGACGCTGTTGTTAACCTCGATAAAGGCCTGTACGTTTACCCGGAACCAAAGCGTTACGCTCGTTCTGTTCGTCAGTACAAAATCCTTAACTGTGCGAACTACCATCTGACCCAGGTACGTACCGACTTTTACGACGAATTCTGGGGTCAGGGCCTGCGCGCAGCTCCGAAAAAACAGAAAAAACACTAAGGATCC。


2.一种用于制备如权利要求1所述的流感嗜血杆菌表面蛋白(D15及Pe)的方法，其特征在于：所述方法是：
分别获取流感嗜血杆菌表面蛋白D15及表面蛋白Pe胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段并找到该肽段基因编码序列，优化肽段基因编码序列，并将优化后的肽段基因编码序列用柔性连接肽的编码序列进行连接，形成融合基因；所述流感嗜血杆菌表面蛋白D15及表面蛋白Pe在NCBI蛋白质数据库中的accessionnumber分别为AAX87955及AGT37361；所述柔性连接肽的序列是ggsggsggsggs；同时在该融合基因的5’引入酶切位点NdeI、3’端引入终止信号TAA和酶切位点BamHI后化学合成全基因序列，记为D15pe；
所述D15pe的基因全序列是：
CATATGCAGCGCGTAACCGACAACGACGTTGCAAACATCGTACGTTCTCTGTTTGTGTCCGGCCGTTTCGATGACGTTAAAGCTCACCAGGAAGGTGATGTTCTGGTTGTTTCTGTTGTTGCAAAATCCATCATCAGTGACGTTAAAATCAAGGGCAACTCTATCATCCCAACTGAAGCTCTGAAGCAGAACCTGGACGCTAACGGTTTTAAAGTAGGTGATGTTCTGATCCGTGAAAAGCTGAACGAATTCGCTAAATCCGTTAAGGAGCATTATGCGAGTGTTGGTCGTTACAACGCTACCGTAGAACCGATTGTTAACACTCTGCCGAACAACCGCGCGGAAATCCTGATCCAGATCAACGAAGATGATAAAGCAAAACTGGCTTCTCTGACCTTCAAAGGTAACGAATCTGTATCCTCATCCACTCTTCAGGAACAGATGGAACTGCAGCCGGACTCTTGGTGGAAGCTGTGGGGCAACAAATTCGAAGGCGCGCAGTTCGAAAAAGACCTGCAATCTATTCGTGATTATTACCTGAACAACGGTTATGCAAAAGGTGGTTCTGGTGGTTCTGGTGGTTCTGGTGGTTCTCTGGTAAAAAACGTTAACTACTACATCGACTCTGAATCCATCTGGGTTGATAACCAGGAACCACAGATCGTACACTTCGACGCTGTTGTTAACCTCGATAAAGGCCTGTACGTTTACCCGGAACCAAAGCGTTACGCTCGTTCTGTTCGTCAGTACAAAATCCTTAACTGTGCGAACTACCATCTGACCCAGGTACGTACCGACTTTTACGACGAATTCTGGGGTCAGGGCCTGCGCGCAGCTCCGAAAAAACAGAAAAAACACTAAGGATCC；
所述D15pe基因编码的蛋白质序列是：
MQRVTDNDVANIVRSLFVSGRFDDVKAHQEGDVLVVSVVAKSIISDVKIKGNSIIPTEALKQNLDANGFKVGDVLIREKLNEFAKSVKEHYASVGRYNATVEPIVNTLPNNRAEILIQINEDDKAKLASLTFKGNESVSSSTLQEQMELQPDSWWKLWGNKFEGAQFEKDLQSIRDYYLNNGYAKGGSGGSGGSGGSLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQKKH；
所述D15pe基因编码的蛋白质序列为流感嗜血杆菌表面蛋白D15的50-233aa及表面蛋白Pe的43-130aa；两段蛋白序列中间以柔性连接肽ggsggsggsggs进行连接；
将D15pe的基因全序列按常规方法克隆入原核表达载体pET-28a(+)，转入E.coliBL21(DE3)菌中，用IPTG诱导重组大肠杆菌表达，用Ni2+亲和层析法纯化重组His-D15pe蛋白。


3.一种用于制备抗流感嗜血杆菌表面蛋白(D15及Pe)多克隆抗体的方法，其特征在于：所述方法是将如权利要求2所述的重组His-D15pe蛋白作为免疫抗原，与弗氏佐剂混合后反复人工免疫健康的新西兰大白兔，抽血进行效价测定，分离高效价重组蛋白抗体并进行纯化，最终获得抗流感嗜血杆菌表面蛋白(D15及Pe)多克隆抗体。


4.一种流感嗜血杆菌表面蛋白(Pcp及PilA)，其特征在于：所述流感嗜血杆菌表面蛋白(Pcp及PilA)的蛋白质序列是：
MRPVKIQADNQGVIGTLGGGALGGIAGSAIGGGRGQVIAAVVGAIGGAVAGSKIEEKVSQVNGAELVIKKDDGQEIVVVQKADSSFVAGRRVRIVGGGSNLNVSVLEAAAAKEAAAAKLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYILQATGNAATGVTWTTTCKG；
用于编码所述流感嗜血杆菌表面蛋白(Pcp及PilA)的蛋白质的基因全序列是：
CATATGCGCCCGGTTAAAATCCAGGCTGATAACCAGGGTGTAATCGGCACCCTGGGCGGCGGCGCTCTGGGCGGTATCGCAGGTTCTGCTATCGGCGGCGGTCGCGGCCAGGTTA...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨波，李杰，胡征，王毅，
申请(专利权)人：湖北工业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42