基于肺炎克雷伯菌表面蛋白抗体的肺炎克雷伯菌Elisa检测试剂盒及制备方法技术

本发明专利技术涉及一种快速检测肺炎克雷伯菌的Elisa检测试剂盒及其制备方法。该试剂盒包含有：包被抗肺炎克雷伯菌ABC transporter substrate‑binding protein receptor及GlpQ蛋白多克隆抗体的酶标板、抗肺炎克雷伯菌FepA及MltD蛋白多克隆抗体、肺炎克雷伯菌阳性对照、阴性对照、洗涤液、酶标二抗、酶显色底物和终止液。本发明专利技术的试剂盒对肺炎克雷伯菌四种特异性表面蛋白进行联合检测，大大提高了肺炎克雷伯菌检测的灵敏度、特异性和可重复性，可用于对肺炎克雷伯菌非诊断性检测及研究工作。

ELISA kit and preparation method of Klebsiella pneumoniae based on the surface protein antibody of Klebsiella pneumoniae

The invention relates to an ELISA detection kit for rapid detection of Klebsiella pneumoniae and a preparation method thereof. The kit contains: enzyme plates containing polyclonal antibodies against Klebsiella pneumoniae ABC transporter substrate \u2011 binding protein receptor and glpq protein, polyclonal antibodies against Klebsiella pneumoniae fepa and mltd protein, positive control, negative control, washing solution, enzyme BIAB, enzyme chromogenic substrate and termination solution. The kit can jointly detect four specific surface proteins of Klebsiella pneumoniae, greatly improving the sensitivity, specificity and repeatability of Klebsiella pneumoniae detection, and can be used for non diagnostic detection and research work of Klebsiella pneumoniae.

【技术实现步骤摘要】
基于肺炎克雷伯菌表面蛋白抗体的肺炎克雷伯菌Elisa检测试剂盒及制备方法
本专利技术属于生物技术及传染病诊断研究领域，涉及一种Elisa检测试剂盒，尤其涉及一种基于肺炎克雷伯菌表面蛋白抗体的肺炎克雷伯菌Elisa检测试剂盒及制备方法。
技术介绍
肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)，又称肺炎杆菌或Friedlander杆菌，是最早被认识可引起肺炎的革兰阴性杆菌。半个世纪以前，革兰阴性杆菌肺炎(gram-negativebacillarypneumonia，GNBP)曾被认为是一种非常少见的疾病，很少受到临床关注。除克雷白杆菌外，几乎没有关于革兰阴性杆菌(gram-negativebacterium，GNB)引起肺炎的报道。近二、三十年来，随着易感人群的改变、抗菌药物广泛应用与耐药菌的变迁以及各种微生物检测技术的提高与普及，GNBP已成为进入抗生素时代的现代医学的一种重要疾病。肺炎克雷伯菌常存在于人体上呼吸道和肠道，当机体抵抗力降低时，便经呼吸道进入肺内而引起大叶或小叶融合性实变，是肠杆菌科克雷伯菌属中对人致病性较强的重要条件致病菌和医源性感染菌。据北京协和医院的统计，肺炎克雷伯杆菌肺炎的发病率为40.9％。世界范围的统计，肺炎克雷伯杆菌肺炎占全部肺炎1％～8％，仅次于铜绿假单胞菌及金黄色葡萄球菌肺炎。社会获得性肺炎(community-acquiredpneumonia，CAP)的实际调查受到诸多因素的限制，缺乏统一的报告。肺炎克雷伯杆菌肺炎占CAP中革兰阴性杆菌肺炎发病率的16％～64％，现认为肺炎克雷白杆菌是CAP常见的病原菌之一。目前检测呼吸道中该病原体的方法主要以传统方法为主，即分离鉴定法，该方法所需时间长，一般要2-3天，很难满足快速鉴定的需要；近几年发展起来的PCR技术，是一种快速、灵敏、特异性好的技术，但是目前该技术还是依赖于传统方法的前增菌步骤，而增菌液中往往还有PCR抑制剂，从而影响扩增的效果。同时，该技术还需要专业的检测设备，不适合进行床旁检测。此外，该项技术由于过于灵敏，经常会出现假阳性。以抗体为基础的免疫学检测已成为人体病原微生物检测不可或缺的重要技术手段。目前已发展了多种特异性免疫检测技术，如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)、荧光免疫分析(FIA)、化学发光免疫分析(CIA)、免疫沉淀反应、免疫凝集反应、ELISA检测试剂盒、免疫胶体金试纸条、免疫乳胶检测试剂等。其中ELISA等多种以抗体为基础的免疫学检测技术，以其简便、快速、灵敏、准确、实用的特点已成为病原微生物检测不可或缺的重要手段。因而，研究开发具有自主知识产权的病原微生物的抗体，是开发拥有自主知识产权的ELISA检测方法的基础。抗原成分的选择是检测特异性的关键。肺炎克雷伯菌ABCtransportersubstrate-bindingproteinreceptor、FepA、GlpQ及MltD蛋白均是位于细胞表面的重要分子，本研究选用具有种间特异性的表面蛋白ABCtransportersubstrate-bindingproteinreceptor、FepA、GlpQ及MltD等作为检测标的物，通过基因重组的方式制备重组抗原，进而制备特异性良好的多克隆抗体，并将其应用于制Elisa检测试剂盒。
技术实现思路
为了解决
技术介绍
中存在的上述技术问题，本专利技术提供了一种可提高肺炎克雷伯菌检测的灵敏度、特异性及可重复性强、操作简单、成本低廉以及快捷迅速地对肺炎克雷伯菌进行检测的基于肺炎克雷伯菌表面蛋白抗体的肺炎克雷伯菌Elisa检测试剂盒及制备方法。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种基于肺炎克雷伯菌表面蛋白抗体的肺炎克雷伯菌Elisa检测试剂盒，其特征在于：所述基于肺炎克雷伯菌表面蛋白抗体的肺炎克雷伯菌Elisa检测试剂盒包括包被抗肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABCtransportersubstrate-bindingproteinreceptor及GlpQ)的多克隆抗体的酶标板、抗肺炎克雷伯菌表面蛋白(FepA及MltD)多克隆抗体、肺炎克雷伯菌阳性对照、阴性对照、洗涤液、酶标二抗、酶显色底物以及终止液；所述肺炎克雷伯菌阳性对照是灭活的肺炎克雷伯菌菌液；所述阴性对照是灭活的大肠杆菌菌液；所述洗涤液的组分及含量是：磷酸氢二钠1.4g/L，磷酸二氢钠0.2g/L，氯化钠8.5g/L，Tween-200.5mL/L，所述洗涤液的pH＝7.4；所述酶标二抗是辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG；所述酶显色底物是TMB显色液；所述终止液是1MHCL溶液。一种基于肺炎克雷伯菌表面蛋白抗体的肺炎克雷伯菌Elisa检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述基于肺炎克雷伯菌表面蛋白抗体的肺炎克雷伯菌Elisa检测试剂盒包括包被抗肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABCtransportersubstrate-bindingproteinreceptor及GlpQ)的多克隆抗体的酶标板、抗肺炎克雷伯菌表面蛋白(FepA及MltD)多克隆抗体、肺炎克雷伯菌阳性对照、阴性对照、洗涤液、酶标二抗、酶显色底物以及终止液；所述肺炎克雷伯菌阳性对照是灭活的肺炎克雷伯菌菌液；所述阴性对照是灭活的大肠杆菌菌液；所述洗涤液的组分及含量是：磷酸氢二钠1.4g/L，磷酸二氢钠0.2g/L，氯化钠8.5g/L，Tween-200.5mL/L，所述洗涤液的pH＝7.4；所述酶标二抗是辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG；所述酶显色底物是TMB显色液；所述终止液是1MHCL溶液；所述包被抗肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABCtransportersubstrate-bindingproteinreceptor及GlpQ)的多克隆抗体的酶标板的制备方法是：1)抗肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABCtransportersubstrate-bindingproteinreceptor及GlpQ)多克隆抗体的制备：1.1)分别获取肺炎克雷伯菌表面蛋白ABCtransportersubstrate-bindingproteinreceptor及表面蛋白GlpQ胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段并找到该肽段基因编码序列，优化肽段基因编码序列，并将优化后的肽段基因编码序列用柔性连接肽的编码序列进行连接，形成融合基因；所述肺炎克雷伯菌表面蛋白ABCtransportersubstrate-bindingproteinreceptor及表面蛋白GlpQ在NCBI蛋白质数据库中的accessionnumber分别为WP_009653190及WP_004214637；所述柔性连接肽的序列是ggsggsggsggs；同时在该融合基因的5’引入酶切位点NdeI、3’端引入终止信号TAA和酶切位点BamHI后化学合成全基因序列，记为Abcglp；所述Abcglp的基因全序列是：CATATGGAAATCGAAAAAAGCGGTACTCTGAAAGTTGCAACCGAGGACGACTATGCACCGTTCAACTTCATGAACAACGGCCAA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABC transporter substrate-binding proteinreceptor及GlpQ)，其特征在于：所述肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABC transportersubstrate-binding protein receptor及GlpQ)的蛋白质序列是：/nMEIEKSGTLKVATEDDYAPFNFMNNGQADGFNKDMLEELRKYAKFHVDQSILPWTGLLAAVSTGQYDMALTGAVITDERLKVFDFTPPWASAQHYFVKRAGDTSLNTIADLSGKKVGVQAGSALLARLPELKAMLEKTGGKLGPVVEYPSYPEAYADLANKRLDYVINVVISVNDLAKAKPKVFGGSGGSGGSGGSDRLVVLHDHYLDRVTDVAQRFPQRARKDGRFYAIDFTLDEIKSLKFTEGFEPKNGKNVQTYPGRFPMGKSDFRIHTFEEEIEFVQGLNHSTGKNIGIYPEIKAPWFHHQEGKDIAASTLKVLKEYGYTSKQDKVYLQCFDANELKRIKNELEPKMGMDLNLVQL；/n用于编码肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABC transporter substrate-binding proteinreceptor及GlpQ)的蛋白质的基因全序列是：/nCATATGGAAATCGAAAAAAGCGGTACTCTGAAAGTTGCAACCGAGGACGACTATGCACCGTTCAACTTCATGAACAACGGCCAAGCTGACGGCTTCAACAAAGACATGCTGGAAGAACTGCGTAAGTATGCGAAATTCCATGTGGACCAAAGCATCCTGCCGTGGACTGGCCTGCTGGCAGCCGTATCTACTGGCCAGTACGACATGGCACTGACCGGCGCAGTTATCACCGACGAACGTCTGAAAGTTTTCGACTTCACTCCGCCGTGGGCATCCGCTCAGCATTACTTCGTTAAACGTGCAGGCGACACCTCTCTGAACACTATTGCAGACTTGTCCGGTAAGAAAGTTGGCGTACAGGCAGGTAGCGCTCTGCTGGCACGTCTGCCGGAACTGAAAGCAATGCTGGAGAAAACTGGCGGTAAATTAGGCCCGGTGGTTGAATATCCGTCTTACCCGGAAGCATACGCTGACCTGGCTAACAAACGTCTGGATTATGTTATCAACGTTGTTATCTCCGTTAACGACCTGGCAAAAGCTAAACCGAAGGTTTTCGGTGGTTCTGGTGGTTCTGGTGGTTCTGGTGGTTCTGACCGTCTGGTTGTACTGCACGATCATTACTTGGACCGTGTTACTGACGTTGCTCAGCGCTTCCCTCAGCGTGCGCGCAAAGACGGTCGTTTTTACGCTATCGACTTTACCCTGGATGAAATCAAATCTCTCAAATTCACTGAAGGTTTCGAGCCTAAAAACGGCAAAAACGTTCAAACCTATCCTGGTCGTTTCCCGATGGGTAAAAGCGATTTTCGCATCCACACTTTCGAAGAGGAAATCGAATTCGTACAGGGTCTCAACCACTCTACTGGTAAAAACATCGGTATCTACCCGGAAATCAAAGCACCGTGGTTCCACCACCAGGAAGGTAAAGACATCGCTGCTTCCACCCTCAAAGTTCTGAAAGAATACGGTTACACCTCTAAGCAGGATAAAGTGTACCTGCAGTGCTTCGACGCTAATGAACTGAAGCGTATCAAAAACGAACTGGAGCCGAAAATGGGCATGGACCTGAACCTGGTACAGCTGTAAGGATCC。/n...

【技术特征摘要】
1.一种肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABCtransportersubstrate-bindingproteinreceptor及GlpQ)，其特征在于：所述肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABCtransportersubstrate-bindingproteinreceptor及GlpQ)的蛋白质序列是：
MEIEKSGTLKVATEDDYAPFNFMNNGQADGFNKDMLEELRKYAKFHVDQSILPWTGLLAAVSTGQYDMALTGAVITDERLKVFDFTPPWASAQHYFVKRAGDTSLNTIADLSGKKVGVQAGSALLARLPELKAMLEKTGGKLGPVVEYPSYPEAYADLANKRLDYVINVVISVNDLAKAKPKVFGGSGGSGGSGGSDRLVVLHDHYLDRVTDVAQRFPQRARKDGRFYAIDFTLDEIKSLKFTEGFEPKNGKNVQTYPGRFPMGKSDFRIHTFEEEIEFVQGLNHSTGKNIGIYPEIKAPWFHHQEGKDIAASTLKVLKEYGYTSKQDKVYLQCFDANELKRIKNELEPKMGMDLNLVQL；
用于编码肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABCtransportersubstrate-bindingproteinreceptor及GlpQ)的蛋白质的基因全序列是：
CATATGGAAATCGAAAAAAGCGGTACTCTGAAAGTTGCAACCGAGGACGACTATGCACCGTTCAACTTCATGAACAACGGCCAAGCTGACGGCTTCAACAAAGACATGCTGGAAGAACTGCGTAAGTATGCGAAATTCCATGTGGACCAAAGCATCCTGCCGTGGACTGGCCTGCTGGCAGCCGTATCTACTGGCCAGTACGACATGGCACTGACCGGCGCAGTTATCACCGACGAACGTCTGAAAGTTTTCGACTTCACTCCGCCGTGGGCATCCGCTCAGCATTACTTCGTTAAACGTGCAGGCGACACCTCTCTGAACACTATTGCAGACTTGTCCGGTAAGAAAGTTGGCGTACAGGCAGGTAGCGCTCTGCTGGCACGTCTGCCGGAACTGAAAGCAATGCTGGAGAAAACTGGCGGTAAATTAGGCCCGGTGGTTGAATATCCGTCTTACCCGGAAGCATACGCTGACCTGGCTAACAAACGTCTGGATTATGTTATCAACGTTGTTATCTCCGTTAACGACCTGGCAAAAGCTAAACCGAAGGTTTTCGGTGGTTCTGGTGGTTCTGGTGGTTCTGGTGGTTCTGACCGTCTGGTTGTACTGCACGATCATTACTTGGACCGTGTTACTGACGTTGCTCAGCGCTTCCCTCAGCGTGCGCGCAAAGACGGTCGTTTTTACGCTATCGACTTTACCCTGGATGAAATCAAATCTCTCAAATTCACTGAAGGTTTCGAGCCTAAAAACGGCAAAAACGTTCAAACCTATCCTGGTCGTTTCCCGATGGGTAAAAGCGATTTTCGCATCCACACTTTCGAAGAGGAAATCGAATTCGTACAGGGTCTCAACCACTCTACTGGTAAAAACATCGGTATCTACCCGGAAATCAAAGCACCGTGGTTCCACCACCAGGAAGGTAAAGACATCGCTGCTTCCACCCTCAAAGTTCTGAAAGAATACGGTTACACCTCTAAGCAGGATAAAGTGTACCTGCAGTGCTTCGACGCTAATGAACTGAAGCGTATCAAAAACGAACTGGAGCCGAAAATGGGCATGGACCTGAACCTGGTACAGCTGTAAGGATCC。


2.一种用于制备如权利要求1所述的肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABCtransportersubstrate-bindingproteinreceptor及GlpQ)的方法，其特征在于：所述制备方法是：
分别获取肺炎克雷伯菌表面蛋白ABCtransportersubstrate-bindingproteinreceptor及表面蛋白GlpQ胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段并找到该肽段基因编码序列，优化肽段基因编码序列，并将优化后的肽段基因编码序列用柔性连接肽的编码序列进行连接，形成融合基因；所述肺炎克雷伯菌表面蛋白ABCtransportersubstrate-bindingproteinreceptor及表面蛋白GlpQ在NCBI蛋白质数据库中的accessionnumber分别为WP_009653190及WP_004214637；所述柔性连接肽的序列是ggsggsggsggs；同时在该融合基因的5’引入酶切位点NdeI、3’端引入终止信号TAA和酶切位点BamHI后化学合成全基因序列，记为Abcglp；
所述Abcglp的基因全序列是：
CATATGGAAATCGAAAAAAGCGGTACTCTGAAAGTTGCAACCGAGGACGACTATGCACCGTTCAACTTCATGAACAACGGCCAAGCTGACGGCTTCAACAAAGACATGCTGGAAGAACTGCGTAAGTATGCGAAATTCCATGTGGACCAAAGCATCCTGCCGTGGACTGGCCTGCTGGCAGCCGTATCTACTGGCCAGTACGACATGGCACTGACCGGCGCAGTTATCACCGACGAACGTCTGAAAGTTTTCGACTTCACTCCGCCGTGGGCATCCGCTCAGCATTACTTCGTTAAACGTGCAGGCGACACCTCTCTGAACACTATTGCAGACTTGTCCGGTAAGAAAGTTGGCGTACAGGCAGGTAGCGCTCTGCTGGCACGTCTGCCGGAACTGAAAGCAATGCTGGAGAAAACTGGCGGTAAATTAGGCCCGGTGGTTGAATATCCGTCTTACCCGGAAGCATACGCTGACCTGGCTAACAAACGTCTGGATTATGTTATCAACGTTGTTATCTCCGTTAACGACCTGGCAAAAGCTAAACCGAAGGTTTTCGGTGGTTCTGGTGGTTCTGGTGGTTCTGGTGGTTCTGACCGTCTGGTTGTACTGCACGATCATTACTTGGACCGTGTTACTGACGTTGCTCAGCGCTTCCCTCAGCGTGCGCGCAAAGACGGTCGTTTTTACGCTATCGACTTTACCCTGGATGAAATCAAATCTCTCAAATTCACTGAAGGTTTCGAGCCTAAAAACGGCAAAAACGTTCAAACCTATCCTGGTCGTTTCCCGATGGGTAAAAGCGATTTTCGCATCCACACTTTCGAAGAGGAAATCGAATTCGTACAGGGTCTCAACCACTCTACTGGTAAAAACATCGGTATCTACCCGGAAATCAAAGCACCGTGGTTCCACCACCAGGAAGGTAAAGACATCGCTGCTTCCACCCTCAAAGTTCTGAAAGAATACGGTTACACCTCTAAGCAGGATAAAGTGTACCTGCAGTGCTTCGACGCTAATGAACTGAAGCGTATCAAAAACGAACTGGAGCCGAAAATGGGCATGGACCTGAACCTGGTACAGCTGTAAGGATCC；
所述Abcglp基因编码的蛋白质序列是：
MEIEKSGTLKVATEDDYAPFNFMNNGQADGFNKDMLEELRKYAKFHVDQSILPWTGLLAAVSTGQYDMALTGAVITDERLKVFDFTPPWASAQHYFVKRAGDTSLNTIADLSGKKVGVQAGSALLARLPELKAMLEKTGGKLGPVVEYPSYPEAYADLANKRLDYVINVVISVNDLAKAKPKVFGGSGGSGGSGGSDRLVVLHDHYLDRVTDVAQRFPQRARKDGRFYAIDFTLDEIKSLKFTEGFEPKNGKNVQTYPGRFPMGKSDFRIHTFEEEIEFVQGLNHSTGKNIGIYPEIKAPWFHHQEGKDIAASTLKVLKEYGYTSKQDKVYLQCFDANELKRIKNELEPKMGMDLNLVQL；
所述Abcglp基因编码的蛋白质序列为肺炎克雷伯菌表面蛋白ABCtransportersubstrate-bindingproteinreceptor的29-211aa及表面蛋白GlpQ的69-232aa；两段蛋白序列中间以柔性连接肽ggsggsggsggs进行连接；
将Abcglp的基因全序列按常规方法克隆入原核表达载体pET-28a(+)，转入E.coliBL21(DE3)菌中，用IPTG诱导重组大肠杆菌表达，用Ni2+亲和层析法纯化重组His-Abcglp蛋白。


3.一种用于制备抗肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABCtransportersubstrate-bindingproteinreceptor及GlpQ)多克隆抗体的方法，其特征在于：所述方法是将如权利要求2所述的重组His-Abcglp蛋白作为免疫抗原，与弗氏佐剂混合后反复人工免疫健康的新西兰大白兔，抽血进行效价测定，分离高效价重组蛋白抗体并进行纯化，最终获得抗肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABCtransportersubstrate-bindingproteinreceptor及GlpQ)多克隆抗体。


4.一种肺炎克雷伯菌表面蛋白(FepA及MltD)，其特征在于：所述肺炎克雷伯菌表面蛋白(FepA及MltD)的蛋白质序列是：
MNDYRNKIEAGYAPVYQNNKGTDLYQWENVPKAVVEGLEGTLNVPVSETVNWTNNITYMLQSKNKETGDRLSIIPEYTLNSTLSWQVRDDVSLQSTFTWYGKQEPKKYNYKGQPVTGSEKNEVSPYSILGLSATWDVTKYVSLTGGVEAAAAKEAAAAKLDSPVDISQLADMAGMPVSKLKTFNAGVKGSTLGASGPKYVMVPQKHAAQLRESLASGDIAAVQPTQLADNTPLTSRSYKVRSGDTISGIASRLGVTTRDLQQWNNLRGSGLKVGQNLVIGAGSSAQRLANNSDSITYRVRKGDSLSSIA；
用于编码所...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨波，程雨洁，胡征，王毅，
申请(专利权)人：湖北工业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42