基于流感嗜血杆菌表面蛋白的乳胶微球免疫层析试纸的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种快速检测流感嗜血杆菌的乳胶免疫层析试纸条的制备方法，该试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫、PVC板组成，结合垫上喷涂有彩色乳胶微球偶联的抗流感嗜血杆菌表面蛋白多克隆抗体，硝酸纤维素膜包被有抗流感嗜血杆菌表面蛋白多克隆抗体的检测线和羊抗兔IgG抗体的质控线。当加入的样品中含有流感嗜血杆菌时，流感嗜血杆菌首先与乳胶‑兔抗流感嗜血杆菌表面蛋白多克隆抗体形成复合物，在毛细作用下迁移至包被有流感嗜血杆菌表面蛋白多克隆抗体的检测线时被捕捉，检测线呈相应的彩色，因而可检测样品中是否含有流感嗜血杆菌。该试纸条具有快速、简捷、灵敏度高，特异性好的优点。

Preparation of immunochromatographic test paper based on the surface protein of Haemophilus influenzae

The invention relates to a preparation method of latex immunochromatography test strip for rapid detection of Haemophilus influenzae. The test strip is composed of sample pad, binding pad, nitrocellulose film, water absorbent pad and PVC plate. The binding pad is coated with polyclonal antibody against Haemophilus influenzae surface protein coupled with color latex microspheres, and the nitrocellulose film is coated with the surface protein of Haemophilus influenzae The detection line of clone antibody and the quality control line of Goat anti rabbit IgG antibody. When the added sample contains Haemophilus influenzae, Haemophilus influenzae first forms a complex with the polyclonal antibody against the surface protein of Haemophilus influenzae of latex \u2011 rabbit, which migrates to the detection line containing the polyclonal antibody against the surface protein of Haemophilus influenzae under the capillary action. The detection line is in corresponding color, so it can be used to detect whether there is Haemophilus influenzae in the sample \u3002 The strip has the advantages of fast, simple, high sensitivity and good specificity.

【技术实现步骤摘要】
基于流感嗜血杆菌表面蛋白的乳胶微球免疫层析试纸的制备方法
本专利技术属于生物检测领域，具体涉及一种基于流感嗜血杆菌表面蛋白的乳胶微球免疫层析试纸的制备方法。
技术介绍
流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae,Hi)是一种没有运动力的革兰氏阴性杆菌。它是于1892年由费佛博士在流行性感冒的瘟疫中发现。它一般都是好氧生物，但可以成长为兼性厌氧生物。流感嗜血杆菌最初被误认为是流行性感冒的病因，但直至1933年，当发现流行性感冒的病毒性病原后，才消除了这种误解。流感嗜血杆菌一般有六种菌株，称为a型、b型(又称乙型)、c型、d型、e型及f型。由流感嗜血杆菌自然产生的疾病只会在人类出现。在婴儿及孩童中，乙型流感嗜血杆菌会引致菌血病症及急性细菌性脑膜炎。偶尔地它会引致蜂窝组织炎、骨髓炎及关节感染。自从1990年开始，美国使用HiB结合型疫苗后，HiB病症的患病率减少至每十万名儿童有1.3名儿童感染。但是，HiB仍然是发展中国家引致婴儿及儿童下呼吸道疾病的主因。没有荚膜的流感嗜血杆菌会引致儿童的耳朵感染(如中耳炎)、眼睛感染(结膜炎)及鼻窦炎，并且联带肺炎。此种细菌对培养的营养需要较为严格且往往寄生在上气道内，因此培养常出现假阴性和假阳性。目前检测呼吸道中该病原体的方法主要以传统方法为主，即分离鉴定法，该方法所需时间长，一般要2-3天，很难满足快速鉴定的需要；近几年发展起来的PCR技术，是一种快速、灵敏、特异性好的技术，但是目前该技术还是依赖于传统方法的前增菌步骤，而增菌液中往往还有PCR抑制剂，从而影响扩增的效果。同时，该技术还需要专业的检测设备，不适合进行床旁检测。以抗体为基础的免疫学检测已成为人体病原微生物检测不可或缺的重要技术手段。目前已发展了多种特异性免疫检测技术，如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)、荧光免疫分析(FIA)、化学发光免疫分析(CIA)、免疫沉淀反应、免疫凝集反应、ELISA检测试剂盒、免疫胶体金试纸条、免疫乳胶检测试剂等。其中免疫乳胶试纸条等多种以抗体为基础的免疫学检测技术，以其简便、快速、灵敏、准确、实用的特点已成为病原微生物检测不可或缺的重要手段。因而，研究开发具有自主知识产权的病原微生物的抗体，是开发拥有自主知识产权的ELISA检测方法、乳胶微球标记检测法等的基础。抗原成分的选择是制备高特异性抗体的关键。流感嗜血杆菌Pe、D15、PCP及PilA蛋白均是位于细胞表面的重要分子，其保守性高，特异性强，抗原性强，表面暴露性高，是较为理想的检测标的物。本研究选用具有种间特异性的表面蛋白Pe、D15、PCP及PilA等作为抗原，在去除与其它细菌相似性高的基因序列，使其与其它细菌抗原的交叉性降低的同时通过基因优化，融合表达等技术手段制备特异性良好的多克隆抗体，并将其应用于制备流感嗜血杆菌乳胶微球免疫层析检测试纸条。
技术实现思路
本专利技术的目的是以多克隆抗体为基础，通过免疫乳胶标记技术研制一种操作简单、成本低廉、快捷迅速的检测流感嗜血杆菌的乳胶微球免疫层析检测试纸条。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：一种基于流感嗜血杆菌表面蛋白的乳胶微球免疫层析试纸的制备方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：1)流感嗜血杆菌表面蛋白(D15+PCP)抗体制备：分别获取流感嗜血杆菌表面蛋白D15及表面蛋白PCP胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段并找到该肽段基因编码序列，优化肽段基因编码序列，并将优化后的肽段基因编码序列用柔性连接肽的编码序列进行连接，形成融合基因；所述流感嗜血杆菌表面蛋白D15及表面蛋白PCP在NCBI蛋白质数据库中的accessionnumber分别为AAX87955及AAX88288；所述柔性连接肽的序列是ggsggsggsggs；同时在该融合基因的5’引入酶切位点NdeI、3’端引入终止信号TAA和酶切位点BamHI后化学合成全基因序列，记为d15pcp；所述d15pcp的基因全序列是：所述d15pcp基因编码的蛋白质序列是：MQRVTDNDVANIVRSLFVSGRFDDVKAHQEGDVLVVSVVAKSIISDVKIKGNSIIPTEALKQNLDANGFKVGDVLIREKLNEFAKSVKEHYASVGRYNATVEPIVNTLPNNRAEILIQINEDDKAKLASLTFKGNESVSSSTLQEQMELQPDSWWKLWGNKFEGAQFEKDLQSIRDYYLNNGYAKGGSGGSGGSGGSRPVKIQADNQGVIGTLGGGALGGIAGSAIGGGRGQVIAAVVGAIGGAVAGSKIEEKVSQVNGAELVIKKDDGQEIVVVQKADSSFVAGRRVRIVGGGSNLNVSVL；所述d75pcp基因编码的蛋白质序列为流感嗜血杆菌表面蛋白D15的50-233aa及表面蛋白PCP的50-154aa；两段蛋白序列中间以柔性连接肽进行连接；将此基因片段按常规方法克隆入原核表达载体pET-28a(+)，用IPTG诱导重组大肠杆菌表达，用Ni2+亲和层析法纯化重组His-D15PCP蛋白；将该重组蛋白作为免疫抗原，与弗氏佐剂混合后反复人工免疫健康的新西兰大白兔，抽血进行效价测定，分离高效价重组蛋白抗体并进行纯化，最终获得流感嗜血杆菌表面蛋白(D15+PCP)抗体；2)流感嗜血杆菌表面蛋白(Pe+pilA)抗体的制备：分别获取流感嗜血杆菌表面蛋白Pe及表面蛋白pilA胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段并找到该肽段基因编码序列，优化该肽段基因编码序列，并将此二段序列用刚性连接肽的编码序列进行连接，形成融合基因；所述流感嗜血杆菌表面蛋白Pe及表面蛋白pilA在NCBI蛋白质数据库中的accessionnumber分别为AGT37361及AAX12377；所述刚性连接肽的序列是eaaakeaaak；同时在该融合基因的5’引入酶切位点NdeI、3’端引入终止信号TAA和酶切位点BamHI后化学合成全基因序列，记为pepil；所述pepil基因全序列是：所述pepil编码的蛋白质序列是：MLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHEAAAAKEAAAAKLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYILQATGNAATGVTWTTTCKG；所述pepil基因编码的蛋白质序列是流感嗜血杆菌表面蛋白Pe的43-130aa及表面蛋白pilA的17-133aa，两个蛋白序列中间以刚性连接肽进行连接；将此基因片段按常规方法克隆入原核表达载体pET-28a(+)，用IPTG诱导重组大肠杆菌表达，用Ni2+亲和层析法纯化重组His-Pepil蛋白；将该重本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种流感嗜血杆菌表面蛋白(D15+PCP)，其特征在于：所述流感嗜血杆菌表面蛋白(D15+PCP)的蛋白质序列是：/nMQRVTDNDVANIVRSLFVSGRFDDVKAHQEGDVLVVSVVAKSIISDVKIKGNSIIPTEALKQNLDANGFKVGDVLIREKLNEFAKSVKEHYASVGRYNATVEPIVNTLPNNRAEILIQINEDDKAKLASLTFKGNESVSSSTLQEQMELQPDSWWKLWGNKFEGAQFEKDLQSIRDYYLNNGYAKGGSGGSGGSGGSRPVKIQADNQGVIGTLGGGALGGIAGSAIGGGRGQVIAAVVGAIGGAVAGSKIEEKVSQVNGAELVIKKDDGQEIVVVQKADSSFVAGRRVRIVGGGSNLNVSVL；/n用于编码所述流感嗜血杆菌表面蛋白(D15+PCP)的核酸基因全序列是：/n

【技术特征摘要】
1.一种流感嗜血杆菌表面蛋白(D15+PCP)，其特征在于：所述流感嗜血杆菌表面蛋白(D15+PCP)的蛋白质序列是：
MQRVTDNDVANIVRSLFVSGRFDDVKAHQEGDVLVVSVVAKSIISDVKIKGNSIIPTEALKQNLDANGFKVGDVLIREKLNEFAKSVKEHYASVGRYNATVEPIVNTLPNNRAEILIQINEDDKAKLASLTFKGNESVSSSTLQEQMELQPDSWWKLWGNKFEGAQFEKDLQSIRDYYLNNGYAKGGSGGSGGSGGSRPVKIQADNQGVIGTLGGGALGGIAGSAIGGGRGQVIAAVVGAIGGAVAGSKIEEKVSQVNGAELVIKKDDGQEIVVVQKADSSFVAGRRVRIVGGGSNLNVSVL；
用于编码所述流感嗜血杆菌表面蛋白(D15+PCP)的核酸基因全序列是：





2.一种流感嗜血杆菌表面蛋白(D15+PCP)的制备方法，其特征在于：所述制备方法是：分别获取流感嗜血杆菌表面蛋白D15及表面蛋白PCP胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段并找到该肽段基因编码序列，优化肽段基因编码序列，并将优化后的肽段基因编码序列用柔性连接肽的编码序列进行连接，形成融合基因；
所述流感嗜血杆菌表面蛋白D15及表面蛋白PCP在NCBI蛋白质数据库中的accessionnumber分别为AAX87955及AAX88288；
所述柔性连接肽的序列是ggsggsggsggs；
同时在该融合基因的5’引入酶切位点NdeI、3’端引入终止信号TAA和酶切位点BamHI后化学合成全基因序列，记为d15pcp；
所述d15pcp的基因全序列是：



所述d15pcp基因编码的蛋白质序列是：
MQRVTDNDVANIVRSLFVSGRFDDVKAHQEGDVLVVSVVAKSIISDVKIKGNSIIPTEALKQNLDANGFKVGDVLIREKLNEFAKSVKEHYASVGRYNATVEPIVNTLPNNRAEILIQINEDDKAKLASLTFKGNESVSSSTLQEQMELQPDSWWKLWGNKFEGAQFEKDLQSIRDYYLNNGYAKGGSGGSGGSGGSRPVKIQADNQGVIGTLGGGALGGIAGSAIGGGRGQVIAAVVGAIGGAVAGSKIEEKVSQVNGAELVIKKDDGQEIVVVQKADSSFVAGRRVRIVGGGSNLNVSVL；
所述d15pcp基因编码的蛋白质序列为流感嗜血杆菌表面蛋白D15的50-233aa及表面蛋白PCP的50-154aa；两段蛋白序列中间以柔性连接肽进行连接；将此基因片段按常规方法克隆入原核表达载体pET-28a(+)，用IPTG诱导重组大肠杆菌表达，用Ni2+亲和层析法纯化重组His-D15PCP蛋白。


3.一种用于制备流感嗜血杆菌表面蛋白(D15+PCP)抗体的方法，其特征在于：所述方法是将如权利要求2所述的重组His-D15PCP蛋白作为免疫抗原，与弗氏佐剂混合后反复人工免疫健康的新西兰大白兔，抽血进行效价测定，分离高效价重组蛋白抗体并进行纯化，最终获得流感嗜血杆菌表面蛋白(D15+PCP)抗体。


4.一种流感嗜血杆菌表面蛋白(Pe+pilA)，其特征在于：所述流感嗜血杆菌表面蛋白(Pe+pilA)的蛋白质序列是：
MLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHEAAAAKEAAAAKLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYILQATGNAATGVTWTTTCKG；
用于编码流感嗜血杆菌表面蛋白(Pe+pilA)的核酸基因全序列是：





5.一种流感嗜血杆菌表面蛋白(Pe+pilA)的制备方法，其特征在于：所述流感嗜血杆菌表面蛋白(Pe+pilA)的制备方法是：
分别获取流感嗜血杆菌表面蛋白Pe及表面蛋白pilA胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段并找到该肽段基因编码序列，优化该肽段基因编码序列，并将此二段序列用刚性连接肽的编码序列进行连接，形成融合基因；所述流感嗜血杆菌表面蛋白Pe及表面蛋白pilA在NCBI蛋白质数据库中的accessionnumber分别为AGT37361及AAX12377；所述刚性连接肽的序列是eaaakeaaak；同时在该融合基因的5’引入酶切位点NdeI、3’端引入终止信号TAA和酶切位点BamHI后化学合成全基因序列，记为pepil；
所述pepil基因全序列是：



所述pep...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨波，陶冶，胡征，王毅，
申请(专利权)人：湖北工业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42