一种人类金属硫蛋白-1融合蛋白表达载体制造技术

本发明专利技术公开了一种人类金属硫蛋白-1融合蛋白表达载体。所述表达载体克隆区的上游包含人类脂肪酸结合蛋白(hFABP6)，下游为金属硫蛋白MT1。本发明专利技术还揭示了应用所述表达载体的方法，包括表达菌株的构建、扩增、诱导表达、融合蛋白纯化的基本方法。本发明专利技术所揭示的hFABP6-MT1融合蛋白表达载体具有如下特点：①高效表达MT蛋白；②可溶性表达。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程和发酵工程领域，涉及一种人类金属硫蛋白-1融合蛋白表达载体，尤其是涉及一种具有伴侣样蛋白功能的人类游离脂肪酸结合蛋白与人类金属硫蛋白的融合表达。
技术介绍
1957年Margoshes和Vallee在研究金属生物学作用时，从动物器官分离出一种新的蛋白质，它含有丰富的巯基，能螯合大量的金属离子，此物质称为金属硫蛋白(英文为Metallothionein，简称MT)。关于金属硫蛋白,全球从1978年到1999年，先后在瑞士、日本、美国共举行了四次国际专题研讨会，第五次国际专题研讨会于2005年10月在北京召开。1987年我国将MT列入[863]计划，“八五”、“九五”重大攻关项目，1994年列入国家级[火炬计划]；2003年MT项目被国家科技部列为“国家科技成果重点推广计划项目,1995年联合国将MT列入向世界各国推荐的生物技术产品。由此可见从国内到国外对MT的研究、开发、推广、应用的高度重视。金属硫蛋白(Metallothionein，MT),又称巯基金属结合蛋白。一类非酶蛋白质，除含有镉(Cd)、锌(Zn)的MT外，在自然界也存在含有铜(Cu)、汞(Hz)、金(Au)、铋(Bi)等元素的MT。MT的蛋白分子内不含有芳香族氨基酸和组氨酸。让MT中50％的金属离子发生解离的pH值分别为：Zn-MT:3.5～4.5；Cd-MT:2.5～3.5；Cu-MT<1.0。因MT缺乏芳香族氨基酸，故在280nm处无吸收峰，然而具有与金属相关的吸收峰。去金属的MT在190nm处有一个吸收峰。所有脊椎动物、多数植物和微生物体内都含有MT。无论是自然产生还是诱导产生的MT，其氨基酸组成基本相同、主要不同在所含金属及其含量。人类MT按分子特征和分布分为四个亚群：MT1、MT2、MT3、MT4。MT1又分9个亚类，MT2又分MT2a和MT2b。MT1和MT2分布全身，MT3分布于脑，MT4主要分布于皮肤。自由基是人体衰老的第一大元凶，自由基还与人类若干中老年疾病紧密相关，导致人体免疫力逐步下降，MT是目前已知的最好的自由基清除剂，减少自由基就能延缓人体衰老步伐。同时，MT也是目前唯一有效的重金属解毒和清除蛋白。人体重金属超标或中毒，损害肝、肾、骨、脑和记忆功能，引发多种疾病。大量的科学实验和临床结果表明：MT在抗电离辐射、紫外线照射、解除金属毒素、治疗或缓解消化道溃疡、心肌梗塞、各种炎症、各种癌症、保护皮肤、减轻吸烟及环境污染对人体的危害及抗过敏等方面均有显著疗效。目前MT产品主要从兔肝、马肾、猪肝和微生物(如粗脉孢菌)等中提取，成本高、产量低，抑制了她的广泛使用，比如食品、饮品、化妆品等。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种人类金属硫蛋白融合蛋白表达载体。本专利技术的目的可通过如下技术方案实现：一种人类金属硫蛋白融合蛋白表达载体，所述的人类金属硫蛋白融合蛋白表达载体是将人类金属硫蛋白1的编码序列作为目标蛋白编码序列插入伴侣样蛋白的融合蛋白表达载体的多克隆区所得；所述的伴侣样蛋白的融合蛋白表达载体上游含有人类游离脂肪酸结合蛋白-6的编码序列，人类游离脂肪酸结合蛋白编码序列下游包含一段柔性接头区和用于插入目标蛋白编码序列的多克隆区。所述的人类游离脂肪酸结合蛋白-6的同源性与人类天然游离脂肪酸结合蛋白的同源性等于或大于85％。所述的人类游离脂肪酸结合蛋白-6的编码序列优选为经过密码子优化的编码序列，所述的人类游离脂肪酸结合蛋白-6的编码序列进一步优选如SEQIDNO.1所示。所述的柔性接头区和多克隆区序列优选如SEQIDNO.3所示。所述的人类金属硫蛋白-1其氨基酸序列优选与人类天然金属硫蛋白的氨基酸序列的同源性等于或大于75％。人类金属硫蛋白-1包括但不限于：人类金属硫蛋白-1a(MT1a，氨基酸序列如SEQIDNO.21所示)、人类金属硫蛋白-1b(MT1b，氨基酸序列如SEQIDNO.22所示)、人类金属硫蛋白-e(MT1e，氨基酸序列如SEQIDNO.23所示)、人类金属硫蛋白-f(MT1f，氨基酸序列如SEQIDNO.24所示)、人类金属硫蛋白-g(MT1g，氨基酸序列如SEQIDNO.25所示)、人类金属硫蛋白-h(MT1h，氨基酸序列如SEQIDNO.26所示)、人类金属硫蛋白-m(MT1m，氨基酸序列如SEQIDNO.27所示)、人类金属硫蛋白-r(MT1r，氨基酸序列如SEQIDNO.28所示)、人类金属硫蛋白-x(MT1x氨基酸序列如SEQIDNO.29所示)；优选人类金属硫蛋白-1b(MT1b，氨基酸序列如SEQIDNO.22所示)。人类金属硫蛋白-1b编码序列优选如SEQIDNO.30所示。所述的表达载体中人类游离脂肪酸结合蛋白-6的编码序列的上游还包含编码用于分离纯化融合蛋白的标签的序列，优选编码组氨酸标签的序列(SEQIDNO.4)。有益效果：1.本专利技术构建的重组表达载体能够促进或诱导被融合的下游人类金属硫蛋白融合蛋白的折叠,具有蛋白伴侣样蛋白的特性。2.该FABP蛋白为人源性,理论上不存在对人体的免疫原性,适于制药工业中解决目标蛋白包涵体问题,并且可以保留融合蛋白一同治药。附图说明图1、hFABP融合蛋白示意图图2、pET28a-hFABP6表达载体物理图图3、pET28-hFABP6-MT1b环状质粒物理图。具体实施方式下面通过具体实施例对本专利技术的应用进行说明，所举的实施例仅是对本专利技术的应用作概括性例示，有助于更好地理解本专利技术的用途，但并不会限制本专利技术应用范围。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例1一种伴侣样蛋白的融合蛋白表达载体的构建方法，包括以下步骤：步骤一、hFABP的编码DNA的人工合成和优化，本实施例以hFABP6为例：(1)取hFBP6氨基酸序列(SEQIDNO.2)逆向翻译成DNA编码序列，经过密码子优先性、核糖体结合区序列优化获得序列(SEQIDNO.1),但不限于此序列，以翻译后的蛋白质氨基酸序列同源性等于或大于85％为限。(2)将该编码序列分段合成寡核苷酸单链DNA(SEQIDNO.5～18)。(3)多聚酶链式反应(PCR)法合成全长编码DNA序列，包含5’-6xHisTag(SEQIDNO.4)、hFBP6氨基酸编码序列、3’-柔性接头序列(Linker)和多克隆区(SEQIDNO.3)。(4)经测序反应验证全长DNA序列(SEQIDN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人类金属硫蛋白融合蛋白表达载体，其特征在于：所述的人类金属硫蛋白融合蛋白表达载体是将人类金属硫蛋白‑1的编码序列作为目标蛋白编码序列插入伴侣样蛋白的融合蛋白表达载体的多克隆区所得；所述的伴侣样蛋白的融合蛋白表达载体上游含有人类游离脂肪酸结合蛋白‑6的编码序列，人类游离脂肪酸结合蛋白编码序列下游包含一段柔性接头区和用于插入目标蛋白编码序列的多克隆区。

【技术特征摘要】
1.一种人类金属硫蛋白融合蛋白表达载体，其特征在于：所述的人类金属硫蛋
白融合蛋白表达载体是将人类金属硫蛋白-1的编码序列作为目标蛋白编码序列
插入伴侣样蛋白的融合蛋白表达载体的多克隆区所得；所述的伴侣样蛋白的融合
蛋白表达载体上游含有人类游离脂肪酸结合蛋白-6的编码序列，人类游离脂肪酸
结合蛋白编码序列下游包含一段柔性接头区和用于插入目标蛋白编码序列的多
克隆区。
2.根据权利要求1所述的人类金属硫蛋白融合蛋白表达载体，其特征在于：人
类游离脂肪酸结合蛋白-6的同源性与人类天然游离脂肪酸结合蛋白的同源性等
于或大于85％。
3.根据权利要求2所述的人类金属硫蛋白融合蛋白表达载体，其特征在于：人
类游离脂肪酸结合蛋白-6的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。
4.根据权利要求2所述的人类金属硫蛋白融合蛋白表达载体，其特征在于：所
述的人类游离脂肪酸结合蛋白-6的编码序列为经过密码子优化的编码，优选如
SEQIDNO.1所示。
5.根据权利要求1所述的人类金属硫蛋白融合蛋白表达载体，其特征在于：所
述的柔性接头区和多克隆区编码序列如SEQIDNO....

【专利技术属性】
技术研发人员：李万波，陕婧婧，卢婵，
申请(专利权)人：盘古基因生物工程南京股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32