金属硫蛋白的制备方法技术

本发明专利技术是一种用蛋白质工程技术高效制备金属硫蛋白的方法。现有技术一直难以得到比较高的产率，虽然融合蛋白表达技术为金属硫蛋白的表达提供了新方法，但是仍存在产率低这个不足之外。本发明专利技术用基因工程方法构建金属硫蛋白或其突变体基因的表达质粒，转入大肠杆菌工程菌中培养发酵，诱导后加入金属离子，继续培养，收集菌体。菌体超声破菌、离心后用谷胱甘肽琼脂糖凝胶４Ｂ亲和层析柱静态吸附，柱上凝血酶酶切，再经柱层析脱盐，盐梯度洗脱，收集目标蛋白。本发明专利技术方法可得纯度达９５％以上的目标蛋白。用本发明专利技术方法制备的猴金属硫蛋白Ⅰ的六个突变体蛋白，产量与纯度均与野生型重组蛋白类似。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是一种用蛋白质工程高效制备金属硫蛋白的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是研究一种操作简单，成本较低，产率高，纯度高，蛋白兼容性好的。本专利技术首先用蛋白质工程方法表达金属硫蛋白或其突变体基因，该方法本领域技术人员均能用现有技术实现。将上述产物的工程菌接种于2YT(含100μg/ml氨苄青霉素)培养液，常规温度35～38℃下快速振荡培养7～16小时，再用新鲜2YT按1∶90～100比例稀释后，继续在常规温度下扩大培养3～4小时，当A600＝0.6-1.0时，加入异丙基β-硫代半乳糖甙(ITPG)至终浓度0.001～1.0mM时，加入金属离子，如Cd2+，Zn2+等，至其浓度是0.1～5.0mM时，继续培养3～6小时，离心收集菌体。上述菌体超声波破菌，离心后，上清液用谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B亲和柱静态亲和吸附，吸附效果用谷胱甘肽硫转移酶(GST)反应来检测，用磷酸缓冲溶液(PBS)淋洗至UV A280的吸收小于0.02时，用缓冲溶液洗去磷酸盐；再用凝血酶酶切缓冲液淋洗，室温下静置酶切，酶切时加入金属离子如Cd2+，Zn2+等，至其浓度为0.1～1.0mM。酶切后经柱层析脱本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种金属硫蛋白的制备方法，其特征是：（１）用蛋白质工程技术表达金属硫蛋白；（２）将金属硫蛋白工程菌接种于２ＹＴ培养液，常规培养７～１６小时，然后用２ＹＴ稀释９０－１００倍后继续扩大培养３～４小时，然后加入ＩＰＴＧ至浓度００１～１．０ ｍＭ继续培养，再加入金属离子至其浓度是０．１～５．０ｍＭ，继续培养３～６小时；（３）菌体超声波破菌，离心，上清液用谷胱甘肽琼脂糖凝胶４Ｂ亲和柱静态吸附，加入金属离子至其浓度是０．１～１．０ｍＭ，在亲和柱上凝血酶酶切，再经柱层析，脱盐，分 离纯化即可。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄仲贤，余文浩，高原，谢毅，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]