金属硫蛋白的制备方法技术

本发明专利技术是一种用蛋白质工程技术高效制备金属硫蛋白的方法。现有技术一直难以得到比较高的产率，虽然融合蛋白表达技术为金属硫蛋白的表达提供了新方法，但是仍存在产率低这个不足之外。本发明专利技术用基因工程方法构建金属硫蛋白或其突变体基因的表达质粒，转入大肠杆菌工程菌中培养发酵，诱导后加入金属离子，继续培养，收集菌体。菌体超声破菌、离心后用谷胱甘肽琼脂糖凝胶４Ｂ亲和层析柱静态吸附，柱上凝血酶酶切，再经柱层析脱盐，盐梯度洗脱，收集目标蛋白。本发明专利技术方法可得纯度达９５％以上的目标蛋白。用本发明专利技术方法制备的猴金属硫蛋白Ⅰ的六个突变体蛋白，产量与纯度均与野生型重组蛋白类似。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是一种用蛋白质工程高效制备金属硫蛋白的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是研究一种操作简单，成本较低，产率高，纯度高，蛋白兼容性好的。本专利技术首先用蛋白质工程方法表达金属硫蛋白或其突变体基因，该方法本领域技术人员均能用现有技术实现。将上述产物的工程菌接种于2YT(含100μg/ml氨苄青霉素)培养液，常规温度35～38℃下快速振荡培养7～16小时，再用新鲜2YT按1∶90～100比例稀释后，继续在常规温度下扩大培养3～4小时，当A600＝0.6-1.0时，加入异丙基β-硫代半乳糖甙(ITPG)至终浓度0.001～1.0mM时，加入金属离子，如Cd2+，Zn2+等，至其浓度是0.1～5.0mM时，继续培养3～6小时，离心收集菌体。上述菌体超声波破菌，离心后，上清液用谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B亲和柱静态亲和吸附，吸附效果用谷胱甘肽硫转移酶(GST)反应来检测，用磷酸缓冲溶液(PBS)淋洗至UV A280的吸收小于0.02时，用缓冲溶液洗去磷酸盐；再用凝血酶酶切缓冲液淋洗，室温下静置酶切，酶切时加入金属离子如Cd2+，Zn2+等，至其浓度为0.1～1.0mM。酶切后经柱层析脱盐，离子交换柱层析柱吸附，盐梯度洗脱等步骤纯化，即可获得目标蛋白。本专利技术的表达载体可以是pGEX-4T-2等质粒；工程菌可以是大肠杆菌，如缺失部分蛋白水解酶的大肠杆菌BL21等；用GST的酶反应监测破菌效率和柱结合效率。本专利技术常规培养，再经稀释后继续扩大培养的温度是30～35℃。本专利技术中酶切时加入的金属离子是两价金属离子如Cd2+，Zn2+等。本专利技术用凝血酶酶切缓冲液淋洗吸附有GST-MT的树脂，然后加入凝血酶酶切缓冲液和适量的凝血酶，在室温下，如15～25℃下静置酶切7～16小时。最后经脱盐，盐梯度洗脱等纯化步骤即可获纯度高达95％以上的目标蛋白。本专利技术用蛋白质工程方法表达金属硫蛋白，亲和柱静态吸附、凝血酶静态酶切方法分离、纯化表达产物，在表达、纯化过程中通过加入金属离子，大大提高了制备效率和产品纯度，成本低，制备蛋白的兼容性好，为高效制备金属硫蛋白提供了有广阔应用应用前景的方法。具体实施例方式用缺失部分蛋白水解酶的大肠杆菌BL21作为发酵工程菌。在金属硫蛋白及其突变体基因上，用PCR方法接入BamHI(5’端)和EcoRI(3’端)两个内切酶位点，然后将其组装在pGEX-4T-2质粒上，构建成表达质粒。将表达质粒转入BL21中，小规模培养后，与甘油溶液(65％(V/V)甘油，0.1M MgSO4，25mMTris-HCl，pH 8.0)1∶1混合均匀，制成甘油菌，-70℃长期保存。发酵前，将含表达质粒的BL21从-70℃取出，接入新鲜2YT(含100μg/mL氨苄青霉素)中，37℃快速振荡(270-330rpm)培养7-16小时，按1∶100转接后，30～35℃继续扩大培养至A600＝0.6-1.0，加入IPTG至终浓度0.01-1.0mM，继续培养，然后加入金属离子如Cd2+至终浓度为0.1-5.0mM，继续培养3-6小时，4℃离心收集菌体。菌体沉淀重悬于1×PBS(含10mM巯基乙醇)中，加溶菌酶(1.5mg/g湿菌体)消化约1小时后，超声波破菌，随后高速离心，用CDNB(1-chloro-2，4-dinitrobenzene)作底物的GST的酶反应，监测破菌效率，上清液用谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B亲和柱静态亲和吸附，GST的酶反应监测结合效率，用1×PBS溶液淋洗至UV A280吸收小于0.02，用Tris-HCl缓冲溶液淋洗，再用加有Cd2+的酶切缓冲液淋洗吸附有GST-MT的树脂，然后加入2倍柱体积的凝血酶酶切缓冲液和适量的凝血酶，静置酶切(25℃，10小时)，得含少量凝血酶和目标蛋白的流出液，再经Sephadex G-25柱层析脱盐，经过DEAE-Cellulose DE52离子交换层析柱吸附，用0-1.0M NaCl的缓冲溶液线性盐梯度洗脱，收集含目标蛋白的洗脱液，浓缩，脱盐后，得到纯度达95％以上的目标蛋白。根据上述事例，制备了猴MT1野生型重组蛋白。产品经12％SDS-PAGE电泳，呈现单一条带，分子量经ESI-MS测定为6284.07 Dalton(计算值为6285.27 Da)。其UV、CD光谱与生物体中获得的野生型蛋白的完全相同。根据本专利技术，我们制备了猴MT1的六个突变体蛋白。产量与纯度均与野生型重组蛋白类似。权利要求1.一种，其特征是(1)用蛋白质工程技术表达金属硫蛋白；(2)将金属硫蛋白工程菌接种于2YT培养液，常规培养7～16小时，然后用2YT稀释90-100倍后继续扩大培养3～4小时，然后加入IPTG至浓度001～1.0mM继续培养，再加入金属离子至其浓度是0.1～5.0mM，继续培养3～6小时；(3)菌体超声波破菌，离心，上清液用谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B亲和柱静态吸附，加入金属离子至其浓度是0.1～1.0mM，在亲和柱上凝血酶酶切，再经柱层析，脱盐，分离纯化即可。2.根据权利要求1所述的，其特征是稀释后扩大培养的温度是30～35℃。3.根据权利要求1所述的，其特征是金属硫蛋白扩大培养时加入的金属离子是两价金属离子。4.根据权利要求1所述的，其特征是酶切时加入的金属离子是两价金属离子。5.根据权利要求1所述的，其特征是静态酶切是在室温下酶切7-16小时。全文摘要本专利技术是一种用蛋白质工程技术高效制备金属硫蛋白的方法。现有技术一直难以得到比较高的产率,虽然融合蛋白表达技术为金属硫蛋白的表达提供了新方法,但是仍存在产率低这个不足之处。本专利技术用基因工程方法构建金属硫蛋白或其突变体基因的表达质粒,转入大肠杆菌工程菌中培养发酵,诱导后加入金属离子,继续培养,收集菌体。菌体超声破菌、离心后用谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B亲和层析柱静态吸附,柱上凝血酶酶切,再经柱层析脱盐,盐梯度洗脱,收集目标蛋白。本专利技术方法可得纯度达95%以上的目标蛋白。用本专利技术方法制备的猴金属硫蛋白I的六个突变体蛋白,产量与纯度均与野生型重组蛋白类似。文档编号C12P21/02GK1348010SQ0113196公开日2002年5月8日 申请日期2001年10月18日 优先权日2001年10月18日专利技术者黄仲贤, 余文浩, 高原, 谢毅 申请人:复旦大学本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种金属硫蛋白的制备方法，其特征是：（１）用蛋白质工程技术表达金属硫蛋白；（２）将金属硫蛋白工程菌接种于２ＹＴ培养液，常规培养７～１６小时，然后用２ＹＴ稀释９０－１００倍后继续扩大培养３～４小时，然后加入ＩＰＴＧ至浓度００１～１．０ ｍＭ继续培养，再加入金属离子至其浓度是０．１～５．０ｍＭ，继续培养３～６小时；（３）菌体超声波破菌，离心，上清液用谷胱甘肽琼脂糖凝胶４Ｂ亲和柱静态吸附，加入金属离子至其浓度是０．１～１．０ｍＭ，在亲和柱上凝血酶酶切，再经柱层析，脱盐，分 离纯化即可。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄仲贤，余文浩，高原，谢毅，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]