一种单克隆抗体的制备方法属于抗体的制备方法技术领域，尤其涉及一种单克隆抗体的制备方法。本发明专利技术提供一种高效、产品质量高的单克隆抗体的制备方法。本发明专利技术包括以下步骤。1、以一定温度保存的BL21-pET-32a/SAG1菌液在含Amp+的LB琼脂平板中划线培养，后挑取单菌落接种液体LB培养基中，摇床250rpm振荡培养；以碱法抽取质粒，并以质粒DNA作为模板进行PCR鉴定和双酶切鉴定。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于抗体的制备方法
，尤其涉及。
技术介绍
SAG1与弓形虫毒力的相关性表现在启动子序列差异和表达水平的高低，SAG1的编码序列具有良好保守性。强毒力虫株的SAG1持续高水平表达，以利于速殖子快速侵入，而弱毒力虫株表达水平较低。SAG1基因序列无内含子，转录起始位点在5’侧翼区上游70bp处的5个完整27 bp的串联重复序列，这些重复序列构成两条DNA链上的开放式阅读框架，它可能对基因表达转录水平的调40节起重要作用。毒力株有5个27 bp重复顺序，非毒力株只有4个，RT-PCR发现毒力株SAG1表达比非毒力株至少要高4倍。SAG1基因翻译起始位点是从第二个蛋氨酸密码子开始，而不是第一个。这与真核细胞共有序列翻译的起始点是一致的，并且与微管蛋白的翻译起始位点相同。该基因初始翻译产物为34.7 kDa具有一个疏水尾的多肽，但天然蛋白其尾部是糖磷脂锚，这说明SAG1蛋白有一个翻译后剪切的修饰。选择性原核表达SAG1基因序列，45去掉尾部信号肽才能使SAG1蛋白折叠为正确构象。因此我们从弓形虫强毒RH株基因组获选择性取了 SAG1不含信号尾的部分序列。
技术实现思路
本专利技术就是针对上述问题，提供一种高效、产品质量高的单克隆抗体的制备方法。为实现上述目的，本专利技术包括以下步骤。1、以一定温度保存的BL21-pET-32a/SAGl菌液在含Amp+的LB琼脂平板中划线培养，后挑取单菌落接种液体LB培养基中，摇床250 rpm振荡培养；以碱法抽取质粒,并以质粒DNA作为模板进行PCR鉴定和双酶切鉴定。2、无菌tip取pET_32a/SAGl质粒加到BL21感受态细胞中，混匀，冰上放置30min ；42 °C热激90 s，迅速置冰上2 min，加入1 ml液体LB培养基，37 1:振荡培养45 min，5000 rpm,4 °C离心3 min，吸去上清约1 ml，管底液体悬浮菌，在无菌条件下涂布于含Amp+抗性的LB平板，37 1:培养至长出菌落为止。3、酶切和PCR鉴定后的pET_32a/SAGl转化表达菌株E.coli BL21感受态；涂于含有Amp+抗性的LB平板，挑选重组单克隆菌落，转接入含LB的锥形瓶中，37 °C、250 rpm振荡培养；待培养4 h时，迅速加入终浓度为IPTG诱导剂，振荡培养，分别取2、3、4、5、6、7、8h的培养样品1 mL高速离心,所得沉淀用于SDS-PAGE和western bolt。作为一种优选方案，本专利技术以-70 °C保存的BL21-pET-32a/SAGl菌液在含Amp+的LB琼脂平板中划线培养7 h，后挑取单菌落接种液体LB培养基中，37 °C摇床250 rpm振荡培养7 h。作为另一种优选方案，本专利技术涂于含有Amp+抗性的LB平板，37 °C培养8 h，挑选重组单克隆菌落，转接入含300 mL LB的1 L锥形瓶中，37 °C、250 rpm振荡培养。待培养4 h时，迅速加入终浓度为1 mM的IPTG诱导剂，37 °C、250 rpm振荡培养，分别取2、3、4、5、6、7、8h的培养样品1 mL高速离心。本专利技术有益效果。本专利技术以PCR和双酶切鉴定了本实验室构建的pET-32a/SAGl质粒，并在大肠杆菌BL21 (DE3)中成功高效表达，纯化后免疫并成功制备了识别天然虫体蛋白的单克隆抗体细胞株。SAG1做为分泌性蛋白以宿主的免疫相关因子为靶标助于弓形虫速殖子侵入宿主细胞。SAG1的蛋白特性是以糖脂锚定位点固定在弓形虫速殖子表面，而经酶修饰后可释放到虫体185外环境中。因此普遍认为SAG1的亲水性较强，其正确的蛋白折叠有赖肽链的正确折叠和二硫键的正确形成，表现在天然的SAG1蛋白在2D电泳中有被发现有多种复杂的存在形式。本研究中使用的pET-32a系统带有硫氧还原蛋白可促进二硫键形成，而我们构建时选择性获取了除N端信号肽序列以保证肽链的正确折叠。【具体实施方式】本专利技术包括以下步骤。1、以一定温度保存的BL21-pET-32a/SAGl菌液在含Amp+的LB琼脂平板中划线培养，后挑取单菌落接种液体LB培养基中，摇床250 rpm振荡培养；以碱法抽取质粒,并以质粒DNA作为模板进行PCR鉴定和双酶切鉴定。2、无菌tip取pET-32a/SAGl质粒加到BL21感受态细胞中，混匀，冰上放置30min ；42 °C热激90 s，迅速置冰上2 min，加入1 ml液体LB培养基，37 1:振荡培养45 min,5000 rpm,4 °C离心3 min，吸去上清约1 ml，管底液体悬浮菌，在无菌条件下涂布于含Amp+抗性的LB平板，37 1:培养至长出菌落为止。3、酶切和PCR鉴定后的pET_32a/SAGl转化表达菌株E.coli BL21感受态；涂于含有Amp+抗性的LB平板，挑选重组单克隆菌落，转接入含LB的锥形瓶中，37 °C、250 rpm振荡培养；待培养4 h时，迅速加入终浓度为IPTG诱导剂，振荡培养，分别取2、3、4、5、6、7、8h的培养样品1 mL高速离心,所得沉淀用于SDS-P AGE和western bolt。本专利技术以-70 °C保存的BL21-pET-32a/SAGl菌液在含Amp+的LB琼脂平板中划线培养7 h，后挑取单菌落接种液体LB培养基中，37 °C摇床250 rpm振荡培养7 h。本专利技术涂于含有Amp+抗性的LB平板，37 °C培养8 h，挑选重组单克隆菌落，转接入含300 mL LB的1 L锥形瓶中，37 °C、250 rpm振荡培养。待培养4 h时，迅速加入终浓度为1 mM的IPTG诱导剂，37 °C、250 rpm振荡培养，分别取2、3、4、5、6、7、8h的培养样品1mL高速离心。重组SAG1经原核表达、纯化后免疫BALB/c小鼠。一免福氏完全佐剂乳化抗原，腹腔注射100 yg/只；14 d后二免，此后均以福氏不完全佐剂乳化，腹腔注射50 μ g/只；14 dl05后三免腹腔注射50 μ g/只；7~10d内尾尖采血测抗体效价应> 1: 10 000 ；14d后四免腹腔注射50 μ g/只；10 d后以PBS溶解的重组蛋白冲击免疫，腹腔注射50 yg/只。冲击免疫后第四天进行融合。以10 μ g/ mL浓度分别包被重组SAG1蛋白，按1: 1000到1: 128000梯度稀释单抗测125定抗体滴度。以山羊抗小鼠IgG 1、IgG 2a、IgG 2b的HRP标记二抗做重组蛋白间接ELISA检测鉴定单抗亚型。 原核表达和纯化的SAG1蛋白以及含空质粒的菌体蛋白进行SDS-PAGE电泳后转NC膜，用含1 %脱脂奶粉的0.01 M PBS在4 °C封闭过夜后，以单抗分泌上清37 °C孵育1 h，0.01 M PBS 5次，二抗HRP标记的羊抗鼠IgG37 °C孵育1 h，PBS漂洗后加底物显色，出135现明显条带后以水冲洗终止。以上内容是结合具体的优选实施方式对本专利技术作的进一步详细说明、不能认定本专利技术的具体实施只局限于这些说明、对于本专利技术所属
的普通技术人员来说、在不脱离本专利技术构思的前提下、还可以做出若干简单推演或替换、都应当视为属于本专利技术所提交的权利要求书确定的保护范围。【主权项】1.，其特征在于包本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种单克隆抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1）以一定温度保存的BL21‑pET‑32a/SAG1菌液在含Amp+的LB琼脂平板中划线培养，后挑取单菌落接种液体LB培养基中，摇床250 rpm振荡培养；以碱法抽取质粒，并以质粒DNA作为模板进行PCR鉴定和双酶切鉴定；2）无菌tip取pET‑32a/SAG1质粒加到BL21感受态细胞中，混匀，冰上放置30 min；42 ℃热激90 s，迅速置冰上2 min，加入1 ml 液体LB培养基，37 ℃振荡培养45 min，5000 rpm、4 ℃离心3 min，吸去上清约1 ml，管底液体悬浮菌，在无菌条件下涂布于含Amp+抗性的LB平板，37 ℃培养至长出菌落为止；3）酶切和PCR鉴定后的pET‑32a/SAG1转化表达菌株E. coli BL21感受态；涂于含有Amp+抗性的LB平板，挑选重组单克隆菌落，转接入含LB的锥形瓶中，37 ℃、250 rpm振荡培养；待培养4 h时，迅速加入终浓度为IPTG诱导剂，振荡培养，分别取2、3、4、5、6、7、8h的培养样品1 mL高速离心，所得沉淀用于SDS‑PAGE和western bolt。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘铮，
申请(专利权)人：刘铮，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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