无动物源性质粒DNA的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种无动物源性质粒DNA的制备方法，包括如下步骤：步骤1，获得无动物源性试剂，包括无动物源性培养基，化学合成的抗生素；步骤2，使用无动物源性培养基制备无动物源的感受态细胞；步骤3，制备无动物源性RNaseA。本发明专利技术方法能够为生物医药领域提供无动物源的质粒DNA，更好的满足法规的需求；可以适用大量提取质粒DNA，通过使用自己生产的RNaseA使最终提取的质粒DNA无内毒素及动物源性污染。

The preparation of plasmid DNA without animal origin

The invention discloses a preparation method of non animal source plasmid DNA, which comprises the following steps: Step 1, obtaining non animal source reagents, including non animal source culture medium and chemically synthesized antibiotics; step 2, preparing non animal source sensitive cells using non animal source culture medium; step 3, preparing non animal source RNaseA. The method of the invention can provide plasmid DNA without animal source for the field of biomedicine, better meet the requirements of laws and regulations; it can be applied to extract a large number of plasmid DNA, and make the final extracted plasmid DNA free of endotoxin and animal source pollution by using RNaseA produced by itself.

【技术实现步骤摘要】
无动物源性质粒DNA的制备方法
本专利技术涉及生物制药领域，具体涉及一种质粒DNA的制备方法，尤其涉及一种无动物源性质粒DNA的制备方法。
技术介绍
质粒DNA制备是生物制药领域，特别是抗体药生产过程中必不可少的材料,它的制备处于生物医药产业链的最前端，承载了编码药物蛋白的关键性序列。质粒制备完成后会被转染进入哺乳动物细胞（如CHOK1,HEK293T,NS0等），进而表达相应的抗体或蛋白，因此保证质粒DNA的无动物源性是基因治疗、DNA疫苗和病毒生产以及生物大分子药物生产等领域所必须的。传统的质粒DNA制备一般分为以下几个步骤：1.质粒DNA的转化；2.质粒在大肠杆菌Ecoli中扩增；3.质粒的分离纯化。目前关于质粒制备的专利主要集中于通过不同的方法来提高质粒纯度或者增加质粒产量，而没有关于生产制备无动物性质粒DNA的方案。经典的质粒DNA制备方法是使用碱裂解的方法，碱裂解法的原理是利用宿主菌染色体DNA与闭环双链质粒DNA的结构状态的差异来提取质粒DNA。当同时碱变性时，线状基因组DNA变性充分而质粒DNA处于拓扑缠绕的自然状态而不能彼此分开。当条件恢复时（酸中和），质粒DNA迅速准确配置重新形成完全天然超螺旋分子，而线状DNA则与破裂的细胞壁，细菌蛋白相互缠绕成大型复合物，被SDS(十二烷基磺酸钠)包盖从而形成沉淀被离心除去。该方法由于需要完全的人为操作，抽提得到质粒纯度不高，存在RNA污染，没有去除内毒素等原因主要用于科研用途。目前已具有商业化的质粒抽提试剂盒，其原理与碱裂解法一致，但通过使用特殊的滤膜来去除内毒素，并通过硅基质吸附柱来纯化质粒DNA，试剂盒能够较快速获得高质量的质粒DNA，但试剂盒中使用RnaseA酶来去除RNA的污染，这些RnaseA都来自于牛胰腺，导致最终纯化得到的质粒DNA也不是无动物源性的，不能满足相关法规的要求。不论是传统的碱裂解法还是商品化的提取试剂盒，上述两种方法除了在提取过程中引入了动物源性成分，在质粒转化和大肠感觉培养过程中也都使用了动物源性的培养基、固体平板、抗生素等，导致纯化得到的质粒DNA完全达不到生物医药领域无动物源的要求。中国专利技术专利申请CN201510529938公开了一种质粒DNA提取方法，主要用于科研用途，缺点如下：1、该方法适用于小量提取质粒DNA,每次提取的菌液量为3-4ml；2、提取的质粒未去除内毒素；3、该方法提取的质粒DNA不是无动物源性的，因为中间使用了普通的抗生素、培养基和RNaseA,该方法获得的质粒DNA无法满足生物医药领域无动物源的需求。目前国内没有无动物源质粒制备的技术和平台，而在生物医药领域，FDA和中国生物制品申报资料中均要求使用原料的无动物源性。因此，本领域亟需研发一种无动物源性质粒DNA的制备方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种无动物源性质粒DNA的制备方法，该方法可以适用大量提取质粒DNA，使最终提取的质粒DNA无内毒素及动物源性污染。质粒的制备具有多个步骤，且在该过程中涉及多种试剂使用。要制备无动物源性质粒DNA，需要将该过程所涉及的试剂和材料全部使用无动物源性。其中，大肠杆菌培养涉及的试剂有抗生素，无动物源性液体培养基和固体平板，以及无动物源性的感受态细胞。质粒DNA提取过程中需要无动物源性的RnaseA。上述这些试剂和材料需要确认均无动物源性，而无动物源性感受态细胞无商业化生产，需要制定方法并测定效率。无动物源性的RnaseA也需要设计方案在Ecoli中表达和纯化，并测定有无酶活。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：一种无动物源性质粒DNA的制备方法，包括如下步骤：步骤1，获得无动物源性试剂，包括无动物源性培养基，化学合成的抗生素；步骤2，使用无动物源性培养基制备无动物源的感受态细胞；步骤3，制备无动物源性RNaseA。作为本专利技术优选的技术方案，步骤1和步骤2中，所述无动物源性培养基为无动物源LB液体培养基或无动物源固体LB培养基；所述无动物源LB液体培养基由以下重量份原料组成：10份大豆蛋白胨，5份酵母粉，10份NaCl；LB液体培养基加入10MNaOH调至pH7.0-7.2，高压除菌即得；所述无动物源固体LB培养基采用如下方法制得:向上述无动物源LB液体培养基加入琼脂，高压除菌。作为本专利技术优选的技术方案，步骤2具体包括如下步骤：第1步，用无动物源固体LB培养基取感受态细胞进行划线，37°C培养16-20h；第2步，挑取单菌落到无动物源LB液体培养基中，37°C摇床过夜培养；第3步，取过夜菌液加入到无动物源LB液体培养基中，37°C摇床培养，使菌液OD600nm为0.3-0.6；第4步，将菌液转移到BD管中，冰上放置10min；第5步，4°C，离心10min倒出培养液，倒置1min；第6步，用0.1MCaCl2-MgCl2溶液重悬细胞沉淀，冰上放置30min；第7步，4°C，离心5min倒出培养液，倒置1min；第8步，用预冷0.1MCaCl2-15%甘油重悬细胞沉淀，将其按100µL/管分装到灭菌EP管中，分装后得到无动物源性感受态细胞，立即放入液氮中，最后冻存于-80°C；第9步，感受态细胞获得后测定无动物源性感受态细胞的效价。作为本专利技术优选的技术方案，第2步中，所述37°C摇床过夜培养，摇床的转速为220rpm。作为本专利技术优选的技术方案，第3步中，所述37°C摇床培养，摇床的转速为280rpm；所述使菌液OD600nm为0.4。作为本专利技术优选的技术方案，第5步和第7步中，所述离心速度为4000rpm。作为本专利技术优选的技术方案，步骤3具体包括如下步骤：步骤A，构建RNaseA表达载体；步骤B，将质粒在Ecoli菌株中转化进行表达；步骤C，纯化获得RNaseA；步骤D，验证RNaseA酶的活性。作为本专利技术优选的技术方案，步骤A中，采用特异的信号肽来介导该RNaseA的表达，所述特异的信号肽的序列如SEQIDNO:1所示；所述RNaseA表达载体的序列如SEQIDNO:2所示,RNaseA的理论分子量为15357.0612。作为本专利技术优选的技术方案，步骤C中，通过镍柱和重力柱两步纯化后获得RNaseA。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：1、能够为生物医药领域提供无动物源的质粒DNA，更好的满足法规的需求；2、能够为后续病毒包装，基因治疗提供强有力的支撑；3、低成本，高标准，提供公司竞争力；本专利技术与中国专利技术专利申请CN201510529938的区别在于：1、本专利技术方法使用了无动物源性的抗生素和培养基；2、本专利技术提取方法使用了MN试剂盒中的溶液,通过滤膜将内毒素去除，且通过使用自己生产的RNaseA使最终提取的质粒DNA无内毒素及动物源性污染。附图说明...

【技术保护点】
1.一种无动物源性质粒DNA的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：/n步骤1，获得无动物源性试剂，包括无动物源性培养基，化学合成的抗生素；/n步骤2，使用无动物源性培养基制备无动物源的感受态细胞；/n步骤3，制备无动物源性RNaseA。/n

【技术特征摘要】
1.一种无动物源性质粒DNA的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，获得无动物源性试剂，包括无动物源性培养基，化学合成的抗生素；
步骤2，使用无动物源性培养基制备无动物源的感受态细胞；
步骤3，制备无动物源性RNaseA。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1和步骤2中，所述无动物源性培养基为无动物源LB液体培养基和无动物源固体LB培养基；所述无动物源LB液体培养基由以下重量份原料组成：10份大豆蛋白胨，5份酵母粉，10份NaCl；LB液体培养基加入10MNaOH调至pH7.0-7.2，高压除菌即得；所述无动物源固体LB培养基采用如下方法制得:向上述无动物源LB液体培养基加入琼脂，高压除菌。


3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2具体包括如下步骤：
第1步，用无动物源固体LB培养基取感受态细胞进行划线，37°C培养16-20h；
第2步，挑取单菌落到无动物源LB液体培养基中，37°C摇床过夜培养；
第3步，取过夜菌液加入到无动物源LB液体培养基中，37°C摇床培养，使菌液OD600nm为0.3-0.6；
第4步，将菌液转移到BD管中，冰上放置10min；
第5步，4°C，离心10min倒出培养液，倒置1min；
第6步，用0.1MCaCl2-MgCl2溶液重悬细胞沉淀，冰上放置30min；
第7步，4°C，离心5min倒出培养液，倒置1mi...

【专利技术属性】
技术研发人员：牟丽丽，汪建峰，
申请(专利权)人：上海药明生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31