一种负载肿瘤细胞外泌体的外周血DC细胞培养方法技术

本发明专利技术涉及DC细胞培养领域，特别涉及一种负载肿瘤细胞外泌体的外周血DC细胞培养方法：PBMC细胞贴壁培养，去除培养液，洗涤细胞；加入DC培养基，培养64‑80h；拍打培养瓶，使贴壁细胞漂浮，补加DC培养基和肿瘤细胞外泌体，培养40‑50h；将细胞悬浮后收集，得到细胞，细胞转移到已采用自体血浆包被的培养容器中，加入上述的DC成熟培养基，培养45‑55h，得到负载肿瘤细胞外泌体的外周血DC细胞。本发明专利技术提供的负载肿瘤细胞外泌体的外周血DC细胞培养方法，肿瘤细胞外泌体能够促进DC细胞的成熟，DC细胞功能表型CD11c/CD83、CD11c/CD86、HLA‑DR/CD40优于未负载外泌体的DC。

A culture method of peripheral blood DC cells loaded with tumor exosomes

The invention relates to the field of DC cell culture, in particular to a culture method of peripheral blood DC cells loaded with tumor cell exosomes: PBMC cell adherence culture, removal of culture medium, washing cells; adding DC culture medium for 64 to 80 hours; beating culture flask to float adherent cells, adding DC culture medium and tumor cell exosome for 40 to 50 hours; collecting cells after suspension and obtaining them. Cells and cells were transferred to culture containers coated with autologous plasma. DC cells loaded with tumor cell exosomes were obtained by adding the above mature DC medium and culturing for 45 to 55 hours. The method for culturing peripheral blood DC cells loaded with tumor cell exosomes provided by the invention can promote the maturation of DC cells, and the functional phenotypes of DC cells CD11c/CD83, CD11c/CD86, HLA DR/CD40 are superior to those of DC without tumor cell exosomes.

【技术实现步骤摘要】
一种负载肿瘤细胞外泌体的外周血DC细胞培养方法
本专利技术涉及DC细胞培养领域，具体而言，涉及一种负载肿瘤细胞外泌体的外周血DC细胞培养方法。
技术介绍
树突状细胞(Dendriticcells，DCs)是体内最有效的抗原提呈细胞，表面表达B7、MHC-Ⅱ类分子、ICAM-1等多种共刺激分子，激活辅助T细胞，促使其分泌IL-2等细胞因子，传递特异性抗原信号，最终活化细胞毒性T细胞，因此，DC细胞在体内起到启动一系列免疫反应的关键作用，在机体的免疫功能以及肿瘤的免疫治理中有重要意义。大多数DC细胞来源于骨髓，由骨髓进入外周血，再分布到全身各组织中，DC广泛分布于除脑以外的全身各脏器，但数量极少，仅占外周血单个核细胞的1％以下。DC前体细胞随血液分布到肠道、心、肝等各非淋巴器官后，发育为未成熟DC细胞。此时，DC细胞具有较强的抗原摄取加工能力，而激活T细胞的能力低下。处于各种非淋巴组织中的未成熟DC细胞摄取抗原后，到达淋巴结、脾脏，此后DC细胞摄取抗原加工的能力减弱直至消失，而致敏T淋巴细胞、启动免疫反应的能力增强，成为成熟DC细胞。在体外培养淋巴细胞的过程中，为了最大程度活化T细胞，需要加入成熟的DC细胞以致敏T细胞。DC细胞的体外培养，通常以外周血单个核细胞作为前体细胞诱导未成熟的DC的细胞。DC细胞促成熟过程非常复杂，涉及到多种因子的共同作用，诸如GM-CSF、TNF、IL-6、IL-4、IL-1β、PGE2、polyI:C、CD40L等等。现有DC细胞负载肿瘤抗原的方法多为裂解肿瘤细胞或者肿瘤组织，提取其中的蛋白后进行负载。提取的蛋白成分复杂，含有肿瘤胞内抗原，激活DC后，DC进入体内提呈给T细胞，但该抗原表达于肿瘤细胞的胞内，因为无法起到特异性杀伤作用。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术发现肿瘤细胞外泌体能够高效激活DC细胞，使得T细胞在后续起到精准抗肿瘤作用。外泌体(exosomes)，是一种脂质分子膜包裹的小囊泡。电镜下观察呈杯状，直径约为40-100nm，密度约为1.13-1.19g/mL。外泌体含有来源细胞的胞质和脂质包膜成分，外泌体内部包含有丰富的mRNA，microRNA和蛋白质成分。外泌体形成是通过多囊泡胞内体(MVE)的细胞区室向内出芽的形式形成，内囊泡内含有蛋白质、microRNA及mRNA。当MVE与细胞膜融合时，内囊泡就被释放到细胞外成为外泌体，释放出来的外泌体能够运行到距离较远的组织而影响细胞的行为和生理上的改变。在肿瘤发生发展的过程中，外泌体参与细胞间的信息传递，进而促进肿瘤血管的生成和实体瘤的转移，肿瘤来源的外泌体已经成为肿瘤分子生物研究的热点之一。恶性肿瘤细胞通过其细胞环境的改变来调节自身的发生、发展和转移，且这种调节可以通过外泌体和肿瘤细胞分泌因子发生。肿瘤细胞来源外泌体既可帮助肿瘤细胞逃逸免疫监视，也可激活肿瘤特异性免疫应答。肿瘤来源外泌体内包含肿瘤特异性抗原，可以在体外产生MHCⅠ类限制性T细胞克隆，且肿瘤来源外泌体可以在体内驱动依赖T细胞的交叉保护作用对抗同源和异源肿瘤。因此可以利用外泌体来源的抗原刺激DC进行靶向抗癌治疗。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种肿瘤细胞外泌体培养方法，包括以下步骤：培养肿瘤细胞至细胞长至85％±10％融合时进行传代；传代培养20-30h，吸走培养液和未贴壁的细胞，并进行清洗，然后加入外泌体专用完全培养液进行培养；45-50h后收集培养液到离心管中，得到富含肿瘤细胞外泌体的培养液；其中，所述外泌体专用完全培养液的组分为：无酚红RPMI-1640培养液和无外泌体FBS，所述无外泌体FBS的添加量为所述无酚红RPMI-1640培养液体积的10％±2％。本专利技术提供的肿瘤细胞外泌体培养方法，方法简便，得到的肿瘤肿瘤细胞外泌体含量高，纯度高。本专利技术中，无外泌体FBS可通过现有方法制备，也可以通过以下方法制备：FBS于100000g-120000g的转速离心8-14h；吸取上层澄清血清，并用0.22μm滤膜过滤，滤液即为无外泌体FBS。进一步地，所述传代按照扩培3-5倍的比例进行。也就是说，一瓶细胞传代得到3-5瓶细胞。进一步地，所述肿瘤细胞的培养采用肿瘤细胞普通完全培养基进行，所述肿瘤细胞普通完全培养基的组分为：RPMI-1640培养液和FBS，所述FBS的添加量为所述RPMI-1640培养液体积的10％±2％。进一步地，用PBS清洗2-3次。清洗是为了进一步去除未去除的残液以及其他碎片。进一步地，每个培养瓶中添加4％-6％体积的外泌体专用完全培养液。如T75细胞培养瓶(250mL)中，加入10-15mL的外泌体专用完全培养液，如T75细胞培养瓶(250mL)中可以为10mL、12mL、15mL等等。本专利技术还提供了一种肿瘤细胞外泌体分离方法，包括以下步骤：上述的肿瘤细胞外泌体培养方法得到的富含肿瘤细胞外泌体的培养液低温离心，去除死细胞和碎片，然后过滤去除囊泡；得到的液体进行超速离心，弃上清，得到肿瘤细胞外泌体。本专利技术提供的肿瘤细胞外泌体分离方法，通过特定的方法处理肿瘤细胞，得到富含肿瘤细胞外泌体的培养液，然后对其进行分离，得到浓度较高、纯度较高的肿瘤细胞外泌体。进一步地，所述低温离心为4±2℃下以2000-2200g离心。通过该速率进行离心，去除死细胞和碎片。进一步地，所述离心的时间为5-10min。进一步地，过滤去除囊泡所用的滤网的孔径为0.22μm。通过过滤，去除较大囊泡。进一步地，得到的液体进行超速离心步骤中，离心的转速为100000-120000g，离心时间为2-3h。通过超速离心，外泌体沉淀下来。进一步地，所述弃上清后还包括将离心容器管壁上的液体去除，离心容器底部的物质即为肿瘤细胞外泌体。通过去除液体，得到更纯净的肿瘤细胞外泌体。离心容器一般为离心管。进一步地，所述分离方法还包括以下步骤：得到的肿瘤细胞外泌体用PBS重悬，保存。如可在-20℃进行保存。即得到的容器底部的肿瘤细胞外泌体加入PBS重悬，保存。对本专利技术分离得到的肿瘤细胞外泌体进行检测，如电镜下以及表面标记蛋白的检测，均符合肿瘤细胞外泌体的特性，说明本专利技术分离得到的肿瘤细胞外泌体是稳定可靠的。另外，推算，以传代接种的肿瘤细胞计算，外泌体的得率为155.32±34.3μg/1×107cells。本专利技术还提供了一种DC成熟培养基，以AIM-V培养基为基准，按以下含量添加以下组分：自体血浆体积百分数为1％±0.2％，GM-CSF50±2ng/mL，IL-450±2ng/mL，TNF-α10ng/mL，PGE-21μg/mL。本专利技术提供的DC成熟培养基，为DCs成熟提供良好的基础。本专利技术还提供了一种负载肿瘤细胞外泌体的外周血DC细胞培养方法，包括以下步骤：(a)PBMC细胞贴壁培养，去除培养液，洗涤细胞；(b)然后加入DC培养基，培养64-80h；(c)拍打培养瓶，使贴壁细胞漂浮，补加DC培养基和肿瘤细胞外泌体，培养40-50h；(d)将细胞悬浮后收集，得到细胞，将细胞转移到已采用自体血浆包被的培养容器中，加入上述的DC成熟培养基，培养45-55h，得到负载肿瘤细胞外泌体的成熟外周血DC细胞。本专利技术提供的负载肿瘤细胞外泌体的外周血DC细胞培养方法本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肿瘤细胞外泌体培养方法，其特征在于，包括以下步骤：培养肿瘤细胞至细胞长至85％±10％融合时进行传代；传代培养20‑30h，吸走培养液和未贴壁的细胞，并进行清洗，然后加入外泌体专用完全培养液进行培养；45‑50h后收集培养液到离心管中，得到富含肿瘤细胞外泌体的培养液；其中，所述外泌体专用完全培养液的组分为：无酚红RPMI‑1640培养液和无外泌体FBS，所述无外泌体FBS的添加量为所述无酚红RPMI‑1640培养液体积的10％±2％。

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤细胞外泌体培养方法，其特征在于，包括以下步骤：培养肿瘤细胞至细胞长至85％±10％融合时进行传代；传代培养20-30h，吸走培养液和未贴壁的细胞，并进行清洗，然后加入外泌体专用完全培养液进行培养；45-50h后收集培养液到离心管中，得到富含肿瘤细胞外泌体的培养液；其中，所述外泌体专用完全培养液的组分为：无酚红RPMI-1640培养液和无外泌体FBS，所述无外泌体FBS的添加量为所述无酚红RPMI-1640培养液体积的10％±2％。2.根据权利要求1所述的肿瘤细胞外泌体培养方法，其特征在于，所述传代按照扩培3-5倍的比例进行；进一步地，所述肿瘤细胞的培养采用肿瘤细胞普通完全培养基进行，所述肿瘤细胞普通完全培养基的组分为：RPMI-1640培养液和FBS，所述FBS的添加量为所述RPMI-1640培养液体积的10％±2％。3.根据权利要求1所述的肿瘤细胞外泌体培养方法，其特征在于，用PBS清洗2-3次；进一步地，每个培养瓶中添加4％-6％体积的外泌体专用完全培养液。4.一种肿瘤细胞外泌体分离方法，其特征在于，包括以下步骤：权利要求1-3任一项所述的肿瘤细胞外泌体培养方法得到的富含肿瘤细胞外泌体的培养液低温离心，去除死细胞和碎片，然后过滤去除囊泡；得到的液体进行超速离心，弃上清，得到肿瘤细胞外泌体。5.根据权利要求4所述的肿瘤细胞外泌体分离方法，其特征在于，所述低温离心为4±2℃下以2000-2200g离心；进一步地，所述离心的时间为5-10min；进一步地，过滤去除囊泡所用的滤网的孔径为0.22μm。6.根据权利要求4-5任一项所述的肿瘤细胞外泌体分离方法，其特征在于，得到的液体进行超速离心步骤中，离心的转速为100000-120000g，离心时间为2-3h。7.根据权利要求6所述的肿瘤细胞外泌体分离方法，其特征在于，所述弃上清后还包括将离心容器管壁上的液体去除，离心容器底部的物质即为肿瘤细胞外泌体；进一步地，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：程旭东，
申请(专利权)人：中生康元生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11