一种治疗性树突状细胞癌症疫苗及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种治疗性树突状细胞癌症疫苗及其应用，属于生物技术领域。本发明专利技术构建了一种能够同时表达肿瘤相关抗原、粒‑巨核细胞集落刺激因子(GM‑CSF)、CD40L和4‑1BBL的穿梭质粒pGBC‑IRES‑WSL及重组腺病毒，并将该重组腺病毒感染人外周血来源的单核细胞获得治疗性树突状细胞癌症疫苗。该癌症疫苗可以通过诱导机体产生抗原特异性T淋巴细胞而发挥抗肿瘤作用，从而用于治疗各种血液系统肿瘤和实体肿瘤。

A therapeutic dendritic cell cancer vaccine and its application

【技术实现步骤摘要】
一种治疗性树突状细胞癌症疫苗及其应用
本专利技术属于生物
中的治疗性癌症疫苗的制备，具体涉及一种治疗性树突状细胞癌症疫苗及其应用。
技术介绍
癌症是全球持续关注的重大健康问题。目前免疫治疗已成为癌症治疗最具前景的方法，包括免疫检查点阻断剂PD-1/PD-L1、CAR-T技术、溶瘤病毒和治疗性癌症疫苗成为免疫治疗开发的重点和热点领域，至今美国FDA已批准了一款治疗性癌症疫苗[Provenge(Sipuleucel-T)]、六款免疫检查点阻断剂[包括CTLA-4抑制剂Ipilimumab(Yervoy)；PD-1抑制剂Nivolumab(Opdivo)、Pembrolizumab(Keytruda)；PD-L1抑制剂Atezolizumab(Tecentriq)、Durvalumab(Imfinzi)和Avelumab(Bavencio)]、二款CAR-T技术产品[Yescarta和Kymriah]和一款溶瘤病毒[talimogenelaherparepvec(Imlygic)，T-Vec]用于临床，取得了良好的临床效果。然而，上述免疫治疗仅对少部分肿瘤有显著疗效，而在大多数肿瘤中并未显示明显优势，这显然与不同肿瘤生物学多样性和机体免疫系统的复杂性相关。其中治疗性癌症疫苗一直是肿瘤免疫治疗领域研究的重点和热点之一。所谓治疗性癌症疫苗是指以治疗为目的的癌症疫苗，通常是通过诱导机体产生肿瘤特异性的主动性免疫反应来实现抗肿瘤效应。可通过多种手段或策略来达到目的，如各种肽疫苗、各种载体疫苗和以树突状细胞(Dendriticcells,DCs)为基础的瘤苗以及各种疫苗组件有机组合的瘤苗，如肽包被DCs、各类载体(RNA、DNA以及病毒载体)转染或感染DCs等，特别是其中的新抗原瘤苗，即利用肿瘤内突变基因编码的突变蛋白产生的多种抗原肽制备的治疗性瘤苗用于肿瘤患者的治疗，即便是个案或小样本的临床研究也呈现难以置信的临床治疗效果。然而，要诱导产生肿瘤特异性的主动性免疫反应，一个关键性环节就是体内的抗原递呈细胞(Antigenpresentingcells，APCs)将肿瘤抗原肽递呈给T细胞识别。而DCs是目前已知的体内最强的APCs，因此治疗性DC瘤苗在治疗性癌症疫苗中占有举足轻重的地位。DCs的主要功能是摄取、加工、处理和呈递抗原，并将抗原信息传递给初始型T细胞，促使T细胞增殖、分化和激活成为能识别和杀伤肿瘤细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，可见抗肿瘤免疫效应最重要的还是T细胞反应，而DCs则成为诱导这种肿瘤特异性T淋巴细胞反应最为关键的一环。例如2010年美国FDA批准的世界上第一个治疗性DCs瘤苗[Sipuleucel-T(Provenge)]，是一种前列腺癌疫苗，用于无症状或微小症状、去势抗性的转移性晚期前列腺癌的治疗，预示癌症免疫治疗时代的到来。继Sipuleucel-T获批后，近十年FDA相继批准了近十款肿瘤免疫治疗相关的产品应用于临床。然而，也有失败的案例，如葛兰素史克(GSK)的MAGE-A3治疗性瘤苗(重组MAGE-A3蛋白加AS15免疫刺激剂，多次肌肉注射)在治疗非小细胞肺癌的III期临床研究(MAGRIT研究)并没有获得预期的效果而提前终止。尽管失败的原因不明，但治疗性DCs瘤苗的设计方面应该值得考虑，以期获得具有更好的临床治疗效果的治疗性癌症疫苗。现有的制备DC瘤苗的培养体系为首先获取患者的外周血单个核细胞(PBMCs)并通过塑料粘附贴壁或CD14+的免疫磁珠分选获得单核细胞后，加入GM-CSF和IL-4，2～3天更换培养基并添加新的细胞因子，大致5天左右单核细胞可分化为不成熟的DCs，此时给予靶抗原刺激，再加入成熟诱导因子(鸡尾酒式细胞因子组合TNF-α、IL-1β、IL-6和PGE2)1～2天，才能获得抗原刺激的成熟DCs，整个制备时间大约7～9天，其操作步骤较多、繁琐，容易出现污染等情况，并且需要多种细胞因子，制备成本较高。虽然经探索已经获得了一种快速获取DCs的方法(FastDC)，即单核细胞在GM-CSF和IL-4的存在下，2～3天即可分化成为DCs，用这种DCs同样也可诱导产生肿瘤特异性的CTL反应，缩短了培养时间。但仍然需要多步骤的实验室操作、添加抗原、补充细胞因子等过程，而且其T细胞的刺激效果并没有得到普遍的认可。通过对共刺激分子和/或具有佐剂功能的生物活性分子的优化组合以期提供复合的刺激信号常常是一种提高治疗性瘤苗功效的合理性设计手段。例如一种针对前列腺癌的PSA-TRICOM疫苗的设计采用了分别用两种病毒载体表达前列腺特异抗原(PSA)和三个共刺激分子或粘附分子组成的免疫佐剂TRICOM(B7.1、ICAM-1和LFA-3)，其中第一种病毒为重组痘苗病毒(vaccinia)，而第二种为重组鸡痘病毒(Fowlpox)，两种病毒分别表达抗原和共刺激分子后联用构成PSA-TRICOM疫苗体系。在临床试验研究中，采用Prime-Boost策略对晚期前列腺癌进行免疫，即先用编码PSA-TRICOM的重组痘苗病毒(rV-PSA-TRICOM)Prime皮下给药两次，每次间隔2周，再用编码PSA-TRICOM的重组鸡痘病毒(rF-PSATRICOM)Boost皮下给药四次，每次间隔4周，并在顺序给药后当日连续3天皮下给予GM-CSF至所有注射疫苗的部位。在一个多中心随机对照双盲II期临床试验研究中，125名去势抗性(castration-resistant)转移性前列腺癌患者被纳入该临床研究，患者按2:1的比例随机分至治疗组(rV-PSA-TRICOMPrime两次加rF-PSATRICOMBoost四次并每次连续3天给予GM-CSF)84名患者，而对照组(空rV两次加空rF四次皮下注射，GM-CSF则用生理盐水替代)41名。研究的主要终点为无进展生存期(PSF)，尽管两组无明显差异，但随访至研究后的第三年，治疗组仍然有30％的患者仍然活着，而对照组只有17％的患者存活，总体生存期治疗组为25.1个月，长出对照组(16.6个月)8.5个月；且治疗组毒副反应轻微，患者均能较好耐受，具有较好的治疗效果。然而，此类治疗性瘤苗需要三种制剂的序贯使用(rV-PSA-TRICOM、rF-PSATRICOM和GM-CSF)，给药方式相对复杂，且是两种病毒体内的直接应用，存在一定的安全性隐患。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本专利技术一个方面提供一种携带有多种目的基因的穿梭质粒pGBC-IRES-WSL，该穿梭质粒的出发载体为pDC511穿梭质粒，所述多种目的基因包括肿瘤相关抗原、粒-巨核细胞集落刺激因子(GM-CSF)、CD40L和4-1BBL的表达基因，且其中所述粒-巨核细胞集落刺激因子(GM-CSF)、CD40L和4-1BBL的表达基因通过两个2A肽序列串联形成一个开放读框，并在所述肿瘤相关抗原的表达序列5’端连接有内部核酸进入位点IRES序列。上述肿瘤相关抗原的表达基因包括但不限于以下基因中的任一种：tWT1、Survivin、融合基因tWT1/Survivin、融本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种携带有多种目的基因的穿梭质粒pGBC-IRES-WSL，其特征在于，所述穿梭质粒命名为pGBC-IRES-WSL，其出发载体为pDC511穿梭质粒，所述多种目的基因包括肿瘤相关抗原、粒-巨核细胞集落刺激因子(GM-CSF)、CD40L和4-1BBL的表达基因，且其中所述粒-巨核细胞集落刺激因子(GM-CSF)、CD40L和4-1BBL的表达基因通过两个2A肽序列串联形成一个开放读框，并在所述肿瘤相关抗原的表达序列5’端连接有内部核酸进入位点IRES序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种携带有多种目的基因的穿梭质粒pGBC-IRES-WSL，其特征在于，所述穿梭质粒命名为pGBC-IRES-WSL，其出发载体为pDC511穿梭质粒，所述多种目的基因包括肿瘤相关抗原、粒-巨核细胞集落刺激因子(GM-CSF)、CD40L和4-1BBL的表达基因，且其中所述粒-巨核细胞集落刺激因子(GM-CSF)、CD40L和4-1BBL的表达基因通过两个2A肽序列串联形成一个开放读框，并在所述肿瘤相关抗原的表达序列5’端连接有内部核酸进入位点IRES序列。


2.根据权利要求1所述的穿梭质粒pGBC-IRES-WSL，其特征在于，所述肿瘤相关抗原的表达基因包括但不限于以下基因中的任一种：tWT1、Survivin、融合基因tWT1/Survivin、融合基因tWT1/Survivin/LAMP-1、MUC1、LMP、HPVE6E7、EGFRvIII、HER-2/neu、MAGEA3、p53(nonmutant和mutant)、NY-ESO-1、PSMA、GD2、CEA、MelanA/MART1、Rasmutant、gp100、Proteinase3(PR1)、bcr-abl、Tyrosinase、PSA、hTERT、Sarcomatranslocationbreakpoints、EphA2、PAP、ML-IAP、AFP、EpCAM、ERG(TMPRSS2ETS融合基因)、NA17、PAX3、ALK、Androgenreceptor、CyclinB1、Polysialicacid、MYCN、RhoC、TRP-2、GD3、FucosylGM1、Mesothelin、PSCA、MAGEA1、sLe(a)、CYP1B1、PLAC1和GM3；
优选地，所述肿瘤相关抗原的表达基因为tWT1(其核苷酸序列可如SEQIDNO:22所示)、Survivin(其核苷酸序列可如SEQIDNO:26所示)、融合基因tWT1/Survivin(其核苷酸序列可如SEQIDNO:34所示)或融合基因tWT1/Survivin/LAMP-1(其核苷酸序列可如SEQIDNO:29所示)。


3.根据权利要求1或2所述的穿梭质粒pGBC-IRES-WSL，其特征在于，所述GM-CSF表达基因的核苷酸序列可如SEQIDNO:7所示；所述CD40L表达基因的核苷酸序列可如SEQIDNO:15所示；所述4-1BBL表达基因的核苷酸序列可如SEQIDNO:11所示。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的穿梭质粒pGBC-IRES-WSL，其特征在于，所述2A肽序列选自E2A、F2A、T2A和P2A中的任一种或两种的组合，由两个2A肽序列串联形成的开放读框中GM-CSF、4-1BBL和CD40L的表达基因的连接位置可以互换。


5.根据权利要求1-4中任一项所述穿梭质粒pGBC-IRES-WSL，其特征在于，所述穿梭质粒pGBC-IRES-WSL的核苷酸序列如SEQIDNO:33所示。


6.权利要求1-5中任一项所述的穿梭质粒pGBC-IRES-WSL的构建方法，其包括以下步骤：
6.1)将CMVp-pA表达盒序列插入pDC511穿梭质粒的多克隆位点中，获得质粒pDC523；
6.2)合成一段寡核苷酸片段，其包含两个2A肽序列和多克隆位点；任选地，选用T2A和P2A时所述寡核苷酸片段的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示的片段；
6.3)将步骤6.2)合成的寡核苷酸片段插入6.1)的质粒pDC523的CMVp-pA表达盒多克隆位点中，获得命名为pDC5232×2A的穿梭质粒...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭晓华，刘春蕙，
申请(专利权)人：深圳豪石生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44