一种特异性杀伤肿瘤细胞的免疫细胞制剂及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种特异性杀伤肿瘤细胞的免疫细胞制剂及其制备方法和应用，通过DC细胞呈递癌睾丸抗原的多组抗原肽段，制备了针对特异性肿瘤细胞系杀伤的DC‑CTL细胞制剂，以达到自体免疫细胞特异性杀伤肿瘤的目的，所述制备方法流程简单，无需使用传统的免疫磁珠分离技术从外周血单个核细胞中分选出CD8+T细胞，且制备得到的DC‑CTL混合细胞制剂纯度高、安全性高、活性高、数量多、能够达到临床级的CTL细胞量，对肿瘤细胞的杀伤特异性强，具有良好的临床应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种特异性杀伤肿瘤细胞的免疫细胞制剂及其制备方法和应用
本专利技术属于生物医药
，具体而言，涉及一种特异性杀伤肿瘤细胞的免疫细胞制剂及其制备方法和应用。
技术介绍
近年来，我国恶性肿瘤的发病率逐年增高，并且大多数患者预后较差，严重危害人类的健康和生活质量(LiangW,GuanW,ChenR,etal.CancerpatientsinSARS-CoV-2infection:anationwideanalysisinChina[J].Thelancetoncology,2020,21(3):335-337.)。目前，手术治疗、放疗、化疗作为针对肿瘤的三大常规治疗方法，远远不能改变肿瘤治疗的现状。随着分子生物学技术的发展、免疫学理论的不断丰富，肿瘤的免疫疗法逐渐兴起，过继性细胞免疫疗法(Adoptivecellimmunotherapy，ACI)已经成为继手术治疗、放疗、化疗后肿瘤的另一种有效治疗手段。过继性细胞免疫疗法是指从肿瘤患者体内分离免疫活性细胞，在体外进行扩增和功能鉴定，然后向患者回输，从而达到直接杀伤肿瘤或激发机体的免疫应答杀伤肿瘤细胞的目的。过继性免疫治疗的关键在于筛选具有肿瘤特异性杀伤作用的效应细胞，对靶细胞即肿瘤细胞产生致命的杀伤，以实现过继性免疫治疗高效低毒的特点。抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CytotoxicTlymphocyte，CTL)由于其具有杀瘤谱广、杀瘤活性高、增殖能力强等特点，已成为过继性免疫治疗中常用的效应细胞，如何提高CTL细胞数量及活性、增强其抗肿瘤特异性是提高过继性免疫治疗效果的关键。树突状细胞(Dendriticcells，DC)是迄今为止发现的效力最强的抗原递呈细胞，具有高效摄取、加工、递呈肿瘤相关抗原，并激活初始免疫反应的独特功能，在免疫反应的诱导和调控中发挥重要作用，DC能够显著刺激初始T细胞增殖，是机体适应性T细胞免疫应答的启动者。目前，DC-CTL制备技术存在的缺陷包括：(1)自体肿瘤组织来源的全肿瘤抗原成分众多，可能引发自身免疫反应，存在安全风险；(2)使用人工合成的单一肿瘤抗原多肽负载DC制备得到的DC-CTL治疗效果有限，只能有效杀伤表达该单一肿瘤抗原的肿瘤细胞；(3)制备流程复杂，需用传统的免疫磁珠分离技术分选出CD8+T细胞，磁性微珠难以完全洗脱而成为了非细胞杂质，对目的细胞的后续培养存在一定的影响，扩增时间长等；(4)现有的细胞因子组合培养扩增的CTL数量不足，细胞活性不高，难以满足临床需求。本专利技术针对上述缺陷，通过DC细胞呈递癌睾丸抗原的多组抗原肽段，制备了针对特异性肿瘤细胞系杀伤的DC-CTL混合细胞制剂，以达到自体免疫细胞特异性杀伤肿瘤的目的，所述制备方法流程简单，无需使用传统的免疫磁珠分离技术从外周血单个核细胞中分选出CD8+T细胞，且制备得到的DC-CTL混合细胞制剂纯度高、安全性高、活性高、数量多、能够达到临床级的CTL细胞量，对肿瘤细胞的杀伤特异性强，具有良好的临床应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种特异性杀伤肿瘤细胞的免疫细胞制剂及其制备方法和应用，所述制备流程简单，无需使用传统的免疫磁珠分离技术从外周血单个核细胞中分选出CD8+T细胞，制备得到的DC-CTL混合细胞纯度高、数量多、能够达到临床级的CTL细胞量，对肿瘤细胞的杀伤特异性强。本专利技术的上述目的通过以下技术方案得以实现：本专利技术的第一方面提供了一种特异性杀伤肿瘤细胞的免疫细胞制剂的制备方法。进一步，所述方法包括如下步骤：(1)制备针对PRAME抗原的DC呈递肽库；(2)采集血液并分离单个核细胞；(3)含特定呈递抗原肽的Mo-DC的培养；(4)T细胞的培养；(5)Mo-DC细胞和T细胞混合培养，获得针对PRAME抗原特异的DC-CTL免疫细胞制剂。进一步，所述步骤(1)中的DC呈递肽库包括在HLA-A*02:01配型免疫细胞靶向PRAME抗原时所呈递可能肽段中可溶性、亲和力和呈递能力均较高的4条肽段；优选地，所述4条肽段的序列如SEQIDNO.1～4所示。进一步，PRAME抗原为黑色素瘤特异性抗原(Preferentiallyexpressedantigenofmelanoma，PRAME)，在88％初发和95％转移黑色素瘤中都有表达，正常皮肤组织和良性黑色素瘤细胞中则不表达。PRAME在细胞内生成后被降解成小分子多肽，并与主要组织相容性复合体(MHC)分子结合形成复合物，进一步被呈递到细胞表面。除了黑色素瘤外，PRAME还在多种肿瘤组织中显著表达，包括肺癌、乳腺癌、鳞状细胞癌、肾细胞癌、霍杰金氏淋巴瘤、头颈部肿瘤、肉瘤及成神经管细胞瘤等，此外，PRAME在急性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病等血液恶性肿瘤中均显著表达。进一步，所述步骤(2)中的血液源自HLA-A*02:01患者的自身外周血液。进一步，所述步骤(2)中的单个核细胞的分离方法包括(但不限于)：葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法(Ficoll-hypaquedensitygradientcentrifugation)，用此方法分离外周血单个核细胞(PBMC)的纯度可达95％，淋巴细胞约占90％，其中T淋巴细胞占80％，B淋巴细胞占4～10％。Ficoll-hypaque混合溶液，又称淋巴细胞分层液，在分离人外周血单个核细胞(PBMC)时，要求其比重为1.077±0.01。进一步，所述步骤(3)中的特定呈递抗原肽的序列如SEQIDNO.1～4所示。进一步，本专利技术所述的所有呈递抗原肽(如SEQIDNO.1～4所示)均通过uniprot-blast(https://www.uniprot.org/blast/)确认为对应抗原肽单一来源，无高同源性的其他抗原来源肽段。理论上不会造成非特异性杀伤。临床已完成对3例患者回输，无副反应发生。这些多肽库可以有效提升DC-CTL细胞的靶向杀伤作用，使得患有表达PRAME肿瘤的HLA-A*02:01配型患者获益。进一步，所述步骤(3)中培养的方法包括如下步骤：(1)将权利要求1步骤(2)中所述的细胞加入到淋巴细胞无血清培养基中进行培养，得到基础培养体系；(2)向步骤(1)所述的基础培养体系中添加IL-4，GM-CSF因子诱导分化得到一次培养体系；(3)向步骤(2)所述的一次培养体系中添加特定呈递抗原肽孵育，并加入TNF-α、IFN-γ刺激诱导得到含特定呈递抗原肽的Mo-DC；优选地，步骤(1)中所述培养的时间为2小时，培养后需去除悬浮细胞；优选地，步骤(2)中所述培养的条件为含500U/mLIL-4，800U/mLGM-CSF，5％HS的淋巴细胞无血清培养基，培养的时间优选为6天，每2天半量换液；优选地，步骤(3)中所述的特定呈递抗原肽的序列如SEQIDNO.1～4所示；优选地，步骤(3)中所述的特定呈递抗原肽的浓度为10-50μg/mL；优选地，步骤(3)中所述添加的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种特异性杀伤肿瘤细胞的免疫细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：/n(1)制备针对PRAME抗原的DC呈递肽库；/n(2)采集血液并分离单个核细胞；/n(3)含特定呈递抗原肽的Mo-DC的培养；/n(4)T细胞的培养；/n(5)Mo-DC细胞和T细胞混合培养，获得针对PRAME抗原特异的DC-CTL免疫细胞制剂。/n

【技术特征摘要】
1.一种特异性杀伤肿瘤细胞的免疫细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)制备针对PRAME抗原的DC呈递肽库；
(2)采集血液并分离单个核细胞；
(3)含特定呈递抗原肽的Mo-DC的培养；
(4)T细胞的培养；
(5)Mo-DC细胞和T细胞混合培养，获得针对PRAME抗原特异的DC-CTL免疫细胞制剂。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的DC呈递肽库包括在HLA-A*02:01配型免疫细胞靶向PRAME抗原时所呈递可能肽段中可溶性、亲和力和呈递能力均较高的4条肽段；
优选地，所述4条肽段的序列如SEQIDNO.1～4所示。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的血液源自HLA-A*02:01患者的自身外周血液。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的特定呈递抗原肽的序列如SEQIDNO.1～4所示。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中培养的方法包括如下步骤：
(1)将权利要求1步骤(2)中所述的细胞加入到淋巴细胞无血清培养基中进行培养，得到基础培养体系；
(2)向步骤(1)所述的基础培养体系中添加IL-4，GM-CSF因子诱导分化得到一次培养体系；
(3)向步骤(2)所述的一次培养体系中添加特定呈递抗原肽孵育，并加入TNF-α、IFN-γ刺激诱导得到含特定呈递抗原肽的Mo-DC；
优选地，步骤(1)中所述培养的时间为2小时，培养后需去除悬浮细胞；
优选地，步骤(2)中所述培养的条件为含500U/mLIL-4，800U/mLGM-CSF，5％HS的淋巴细胞无血清培养基，培养的时间优选为6天，每2天半量换液；
优选地，步骤(3)中所述的特定呈递抗原肽的序列如SEQIDNO.1～4所示；
优选地，步骤(3)中所述的特定呈递抗原肽的浓度为10-50μg/mL；
优选地，步骤(3)中所述添加的时间为培养的第5天；
优选地，步骤(3)中所述的TNF-α、IFN-γ的浓度分别为10ng/mL(1000U)、100IU/mL。


6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中培养的方法包括如下步骤：
(1)在第6天，使用...

【专利技术属性】
技术研发人员：李宜声，于川，刘春蕙，
申请(专利权)人：深圳豪石生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44