一种SARS-CoV-2假病毒小鼠体内包装系统及其制备方法技术方案

本发明专利技术提供了一种假病毒小鼠体内包装系统的制备方法，包括以下步骤：S1基于慢病毒包装质粒系统和睡美人转座子系统构建SARS‑CoV‑2假病毒包装质粒系统，S2将步骤S1中SARS‑CoV‑2假病毒包装质粒系统与睡美人转座酶表达质粒混合通过水动力注射的方式转染小鼠肝细胞，然后睡美人转座子系统将SARS‑CoV‑2假病毒包装所需序列以剪切粘贴的方式整合到小鼠肝细胞的基因组。本发明专利技术可在小鼠体内持续制造分泌SARS‑CoV‑2假病毒，可模拟靶器官被SARS‑CoV‑2病毒持续侵入攻击的过程，从而可模拟出新冠肺炎（COVID‑19）的病理特征。基于SARS‑CoV‑2假病毒小鼠体内包装系统的动物模型安全性高，不需要P3级实验室就能开展研究。利用水动力注射的方式引入SARS‑CoV‑2假病毒包装质粒系统操作简单，成本低。

An in vivo packaging system for sars-cov-2 pseudovirus in mice and its preparation method

【技术实现步骤摘要】
一种SARS-CoV-2假病毒小鼠体内包装系统及其制备方法
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种SARS-CoV-2假病毒小鼠体内包装系统及其制备方法。
技术介绍
SARS-CoV-2假病毒是表面包裹着SARS-CoV-2Spike蛋白（S蛋白）的缺陷病毒颗粒，因而可以利用SARS-CoV-2同样的病毒侵入机制（以ACE2作为受体）将携带的DNA或RNA序列导入细胞，但其携带的是不能指导再次生成病毒的序列，所以可用于研究单次侵入过程的机制及测试药物干预效果，一般情况下实验动物和操作者没有实质性感染的风险。目前假病毒包装通常都是在体外培养的细胞系中完成，可用于SARS-CoV-2假病毒包装的体系由humanimmunodeficiencyvirus-1(HIV-1)或murineleukemiavirus(MLV)等逆转录病毒改造而成。比如常用的慢病毒包装质粒系统（由HIV-1改造而成）经改造后就可用于包装SARS-CoV-2假病毒，即将包膜蛋白质粒中的VSV-G替换成SARS-CoV-2S蛋白，转染HEK293T细胞，即可生成SARS-CoV-2假病毒。但是，体外包装的SARS-CoV-2假病毒用于动物实验时，只能逐次注射假病毒（比如尾静脉注射）去感染动物，实验的时间窗口短，而不能模拟SARS-CoV-2病毒对动物靶器官的持续侵入，且最佳时间窗口难以确定，评估药物干预效果。
技术实现思路
本专利技术的目的是将现有的慢病毒包装质粒体系改造成SARS-CoV-2假病毒包装质粒体系，并通过注射方法导入到小鼠体内肝脏，让小鼠肝脏能持续产生并分泌SARS-CoV-2假病毒颗粒。为实现本专利技术的目的采用以下技术方案：一种假病毒小鼠体内包装系统的制备方法，包括以下步骤：S1构建SARS-CoV-2假病毒包装质粒系统；S2将SARS-CoV-2假病毒包装质粒系统与睡美人转座酶（SleepingBeautytransposase）表达质粒混合通过水动力注射的方式转染小鼠肝细胞，然后睡美人转座子系统将SARS-CoV-2假病毒包装所需序列以剪切粘贴的方式整合到小鼠肝细胞的基因组。作为本专利技术优选实施方式，所述步骤S1中的假病毒包装质粒系统由包膜蛋白质粒（envelopeplasmid）、包装质粒（packagingplasmid）和转移质粒（transferplasmid）组成，其中所述包膜蛋白质粒中的包膜蛋白（ENV）由VSV-G替换成SARS-CoV-2S蛋白。专利技术人首先将常用的慢病毒包装系统的包膜蛋白替换成SARS-CoV-2S蛋白，然后将包膜蛋白质粒、包装质粒和转移质粒中参与病毒包装的序列作为目标序列分别插入到睡美人转座子载体的一对反向末端重复序列（ITR）之间，构建成可以利用睡美人转座子系统整合到细胞基因组中的SARS-CoV-2S假病毒包装质粒系统。作为本专利技术优选实施方式，所述步骤S2具体步骤为：将睡美人转座酶表达质粒与步骤S1构建的假病毒包装质粒系统按比例混合后，从尾静脉采用水动力注射进小鼠体内，获得在小鼠体内持续生产的SARS-CoV-2假病毒。水动力注射方法（将质粒混合在小鼠体重8%-10%的液体中，在10秒内从尾静脉注射进小鼠体内）可以让所有质粒一起进入小鼠的肝细胞。随后睡美人转座酶表达，将包膜蛋白质粒、包装质粒和转移质粒中参与病毒包装的序列(即ITR之间的序列)以剪切粘贴的方式插入到到基因组中。这些SARS-CoV-2假病毒包装元件从小鼠肝细胞的基因组上持续表达，组装成SARS-CoV-2假病毒，从肝细胞分泌到血液中去，可感染表达有人血管紧张素转化酶2（ACE2）的靶器官。但其侵入细胞后，携带的RNA序列只包含转移质粒的部分序列，不能利用感染的细胞制造新的病毒颗粒，安全可控。如果将转移质粒中引入luciferase、GFP等标记蛋白，则可以利用活体/细胞成像技术方便追踪SARS-CoV-2假病毒感染靶器官的情况。本专利技术还提供了一种由本专利技术所述的制备方法在模拟SARS-CoV-2病毒对动物靶器官的持续侵入方面的应用。本专利技术还提供了一种如上述所述制备方法制备的SARS-CoV-2假病毒小鼠体内包装系统，是由包膜蛋白质粒（envelopeplasmid）、包装质粒（packagingplasmid）和转移质粒（transferplasmid）组成，其中所述包膜蛋白质粒中的包膜蛋白（ENV）为SARS-CoV-2S蛋白。作为本专利技术优选实施方式，所述步骤S1中的假病毒包装质粒系统通过水动力注射的方式转染小鼠肝细胞，并利用睡美人转座子系统整合到基因组中持续表达。本专利技术还提供了上述SARS-CoV-2假病毒小鼠体内包装系统在生产SARS-CoV-2假病毒方面的应用。本专利技术还提供了一种持续生产SARS-CoV-2假病毒的动物模型，由如本专利技术所述的假病毒小鼠体内包装系统的制备方法制备而成。作为本专利技术优选实施方式，所述动物为小鼠。作为本专利技术优选实施方式，所述小鼠为能表达人血管紧张素转化酶2的小鼠。本专利技术的有益效果为：1.可在小鼠体内持续制造分泌SARS-CoV-2假病毒，如结合在SARS-CoV-2病毒靶器官表达hACE2的技术（比如hACE2knock-in小鼠），可模拟靶器官被SARS-CoV-2病毒持续侵入攻击的过程，从而可模拟出COVID-19的病理特征。2.这个侵入过程可方便通过标记蛋白被活体成像技术追踪定量，适合用于测试药物干预效果。3.基于SARS-CoV-2假病毒小鼠体内包装系统的动物模型安全性高，不需要P3级实验室就能开展研究。4.利用水动力注射的方式引入SARS-CoV-2假病毒包装质粒体系操作简单，成本低。附图说明图1为SARS-CoV-2假病毒包装质粒构建示意图，其中包括包膜蛋白质粒、包装质粒和转移质粒，其中所述包膜蛋白质粒中的包膜蛋白（ENV）为SARS-CoV-2S蛋白。图2为替换后的包膜蛋白质粒pMD2.G(SARS-CoV-2-S)图谱。图3为构建的包膜蛋白质粒PH-TB-SARS-CoV-2-S图谱。图4为构建的包装质粒PH-TB-GAG-POL图谱。图5为构建的中间质粒pCDH-CMV-LUC图谱。图6构建的转移质粒PH-TB-LUC图谱。图7为睡美人转座子系统工作原理示意图，将目标序列（GeneX）插入到转座子载体一对反向末端重复序列（ITR）之间，睡美人（SleepingBeauty，SB）转座酶能够结合到转座子（即ITR）上，将目标序列以剪切粘贴的方式插入到基因组。图8为水动力注射实现肝细胞转染原理图，水动力注射后，SARS-CoV-2假病毒包装质粒系统会通过内吞小泡中进入到肝细胞，随后借助睡美人转座子系统整合到基因组中，持续生成假病毒颗粒。图9为体内活体成像技术在肺部观察到的luciferase活性示意图。图10为小鼠给不组织HE染色结果示意图。<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种假病毒小鼠体内包装系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1构建SARS-CoV-2假病毒包装质粒系统：首先构建含有SARS-CoV-2 S蛋白的包膜蛋白质粒，再构建包装质粒，最后构建转移质粒，获得SARS-CoV-2假病毒包装质粒系统；/nS2将SARS-CoV-2假病毒包装质粒系统与睡美人转座酶表达质粒混合通过水动力注射的方式转染小鼠肝细胞，然后睡美人转座子系统将SARS-CoV-2假病毒包装所需序列以剪切粘贴的方式整合到小鼠肝细胞的基因组。/n

【技术特征摘要】
1.一种假病毒小鼠体内包装系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1构建SARS-CoV-2假病毒包装质粒系统：首先构建含有SARS-CoV-2S蛋白的包膜蛋白质粒，再构建包装质粒，最后构建转移质粒，获得SARS-CoV-2假病毒包装质粒系统；
S2将SARS-CoV-2假病毒包装质粒系统与睡美人转座酶表达质粒混合通过水动力注射的方式转染小鼠肝细胞，然后睡美人转座子系统将SARS-CoV-2假病毒包装所需序列以剪切粘贴的方式整合到小鼠肝细胞的基因组。


2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2具体步骤为：将睡美人转座子表达质粒与步骤S1构建的假病毒包装质粒系统按比例混合后，从尾静脉采用水动力注射进小鼠体内，获得在小鼠体内持续生产的SARS-CoV-2假病毒...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢鹏，胡策，叶钊成，
申请(专利权)人：广州吉妮欧生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44