【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】制备病毒载体的手段和方法及其用途序列表本申请含有已经以ASCII格式经由EFS-Web递交的序列表并且将该序列表通过引用以其整体并入本文。所述ASCII副本创建于2018年10月31日，名为AVEX-003001WO_ST25.txt，大小为14,639字节。相关申请的交叉引用本申请要求2017年11月8日提交的美国临时专利申请号62/583,035的优先权，该申请的内容通过引用以其全文并入本文。
本公开涉及制备和纯化病毒颗粒的方法以及包含所述病毒颗粒的组合物和用途。
技术介绍
腺相关病毒(AAV)是细小病毒科的一员。AAV基因组由单链DNA分子构成，所述单链DNA分子包含约4.7千碱基(kb)并且由两个主要的开放阅读框(编码非结构Rep(复制)和结构Cap(衣壳)蛋白)组成。AAV编码区的侧翼是两个顺式作用的反向末端重复序列(ITR)，长度约145个核苷酸，带有中断的回文序列(可折叠成在DNA复制启动过程中起引物作用的发夹结构)。除了它们在DNA复制中的作用外，ITR序列已经被证明是病毒整合、从宿主基因组中拯救以及将病毒核酸包封到成熟病毒粒子中所必需的(Muzyczka,(1992)Curr.Top.Micro.Immunol.[微生物免疫学前沿]158:97-129)。AAV存在多种血清型，并提供不同的组织嗜性。已知的血清型例如包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10和AAV11。AAV9描述于美国专利中号7,...
【技术保护点】
1.一种药物组合物，所述药物组合物包含：/na.1-8x 10
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171108 US 62/583,0351.一种药物组合物，所述药物组合物包含：
a.1-8x1013个AAV9病毒载体基因组/mL(vg/mL)；
b.少于约7％的空病毒衣壳；
c.少于约100ng/mL宿主细胞蛋白/1x1013vg/mL；
d.少于约5x106pg/mL残余宿主细胞DNA/1x1013vg/mL；
并且其中所述1-8x1013个AAV9病毒载体基因组/mL中至少约80％是功能性的。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述AAV9病毒载体包含编码运动神经元存活(SMN)蛋白的多核苷酸。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述AAV9病毒载体包含编码甲基-CpG结合蛋白2(MECP2)蛋白的多核苷酸。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述AAV9病毒载体包含编码靶向超氧化物歧化酶1(SOD1)的短发夹RNA(shRNA)的多核苷酸。
5.如权利要求2所述的组合物，其中所述AAV9病毒载体包含经修饰的AAV2ITR、鸡β-肌动蛋白(CB)启动子、巨细胞病毒(CMV)即刻/早期增强子、经修饰的SV40晚期16s内含子、牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号和未经修饰的AAV2ITR。
6.如权利要求2或5所述的组合物，其中所述多核苷酸编码SEQIDNO:2的SMN蛋白。
7.如权利要求2、5或6中任一项所述的组合物，其中所述AAV9病毒载体包含SEQIDNO:1。
8.如权利要求1-7中任一项所述的组合物，所述组合物包含1.7-2.3x1013AAV9vg/mL。
9.如权利要求1-8中任一项所述的组合物，所述组合物包含1.9-2.1x1013AAV9vg/mL。
10.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，所述组合物包含约2x1013AAV9vg/mL。
11.如权利要求1-10中任一项所述的组合物，所述组合物包含少于约5％的空衣壳。
12.如权利要求1-11中任一项所述的组合物，所述组合物包含少于约3％的空衣壳。
13.如权利要求1-12中任一项所述的组合物，所述组合物包含少于约1％的空衣壳。
14.如权利要求1-13中任一项所述的组合物，所述组合物包含以下或由以下组成：1-2x1014vg的所述AAV9病毒载体。
15.如权利要求1-14中任一项所述的组合物，所述组合物包含以下或由以下组成：1.1x1014vg的所述AAV9病毒载体。
16.如权利要求1-15中任一项所述的组合物，所述组合物由1.7x1014vg的所述AAV9病毒载体组成。
17.如权利要求1-16中任一项所述的组合物，其中使用体外细胞测定或体内动物模型测量功能性病毒载体基因组的百分比。
18.一种水性药物配制品，所述水性药物配制品包含：包含编码运动神经元存活(SMN)蛋白的多核苷酸的AAV9病毒载体、Tris缓冲液、氯化镁、氯化钠和泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)，其中所述药物组合物不包含防腐剂。
19.如权利要求18所述的配制品，其中所述AAV9病毒载体还包含经修饰的AAV2ITR、鸡β-肌动蛋白(CB)启动子、巨细胞病毒(CMV)即刻/早期增强子、经修饰的SV40晚期16s内含子、牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号和未经修饰的AAV2ITR。
20.如权利要求18或19所述的配制品，其中所述多核苷酸编码SEQIDNO:2的SMN蛋白。
21.如权利要求18-20中任一项所述的配制品，其中所述AAV9病毒载体包含SEQIDNO:1。
22.如权利要求18-21中任一项所述的配制品，其中所述Tris缓冲液浓度为约10-30nM，例如约20mM。
23.如权利要求18-22中任一项所述的配制品，其中所述配制品的pH为约7.7至约8.3，例如约pH8.0(例如通过USP<791>测量)。
24.如权利要求18-23中任一项所述的配制品，其中所述氯化镁浓度为约0.5-1.5mM，例如约1mM。
25.如权利要求18-24中任一项所述的配制品，其中所述氯化钠浓度为约100-300mM，例如约200mM。
26.如权利要求18-25中任一项所述的配制品，其中所述配制品包含约0.005％w/v泊洛沙姆188。
27.如权利要求18-26中任一项所述的配制品，其中所述配制品的渗透压摩尔浓度为390-430mOsm/kg(例如通过USP<785>测量)。
28.如权利要求18-27中任一项所述的配制品，其中所述AAV9病毒载体是在如权利要求1-17中任一项所述的组合物中。
29.一种治疗有需要的患者的I型脊髓性肌萎缩(SMA)的方法，所述方法包括通过鞘内或静脉内途径给所述患者施用如权利要求18-28中任一项所述的配制品或如权利要求2或5-17中任一项所述的组合物，其中所述患者：
a.九月龄或更小；
b.体重至少约2.6kg；
c.具有双等位基因SMN1无效突变或缺失；以及
d.具有至少一个功能性SMN2拷贝。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述AAV9病毒载体包含经修饰的AAV2ITR、鸡β-肌动蛋白(CB)启动子、巨细胞病毒(CMV)即刻/早期增强子、经修饰的SV40晚期16s内含子、牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号和未经修饰的AAV2ITR。
31.如权利要求29或30所述的方法，其中所述多核苷酸编码SEQIDNO:2的SMN蛋白。
32.如权利要求29-31中任一项所述的方法，其中所述AAV9病毒载体包含SEQIDNO:1。
33.如权利要求29-32中任一项所述的方法，所述方法包括以约1-2.5x1014vg/kg的剂量施用所述病毒载体。
34.如权利要求29-33中任一项所述的方法，所述方法包括以约1.1x1014vg/kg的剂量施用所述病毒载体。
35.如权利要求33或34所述的方法，其中使用ddPCR测量病毒载体基因组的数量。
36.如权利要求29-35中任一项所述的方法，其中所述患者体重不超过约8.5kg。
37.如权利要求29-36中任一项所述的方法，其中所述患者在SMN2基因的至少一个拷贝的外显子7中没有c.859G>C取代。
38.如权利要求29-37中任一项所述的方法，其中在6月龄之前给所述患者施用所述治疗。
39.如权利要求29-38中任一项所述的方法，其中在一个或多个SMA症状发作之前给所述患者施用所述治疗，所述SMA症状选自肌张力减退、运动技能延迟、头部控制不良、圆肩姿势和关节活动过度。
40.如权利要求29-39中任一项所述的方法，其中所述患者的抗AAV9抗体效价为1:100或低于1:100，如在施用前通过ELISA结合免疫测定法测定的。
41.如权利要求29-40中任一项所述的方法，其中所述患者的抗AAV9抗体效价为1:50或低于1:50，如在施用前通过ELISA结合免疫测定法确定的。
42.如权利要求29-41中任一项所述的方法，其中所述患者在施用后具有如通过ELISA结合免疫测定法确定的高于1:100的抗AAV9效价，并且监测约1-8周或直到效价降低到低于1:100。
43.如权利要求29-42中任一项所述的方法，其中所述患者在施用后具有如通过ELISA结合免疫测定法确定的高于1:100的抗AAV9效价，并且监测约1-8周或直到效价降低到低于1:50。
44.如权利要求29-39中任一项所述的方法，其中所述患者在施用前或施用后具有如通过ELISA结合免疫测定法确定的高于1:100的抗AAV9效价，并且例如在施用前或施用后切换到配方喂养。
45.如权利要求29-39中任一项所述的方法，其中所述患者在施用前或施用后具有如通过ELISA结合免疫测定法确定的高于1:50的抗AAV9效价，并且例如在施用前或施用后切换到配方喂养。
46.如权利要求29-45中任一项所述的方法，其中所述患者在施用后具有如通过ELISA结合免疫测定法确定的高于1:100的抗AAV9效价，并使用血浆置换术治疗。
47.如权利要求29-46中任一项所述的方法，其中所述患者在施用后具有如通过ELISA结合免疫测定法确定的高于1:50的抗AAV9效价，并使用血浆置换术治疗。
48.如权利要求29-47中任一项所述的方法，其中所述患者在施用前血小板计数高于约67,000个细胞/ml或高于约100,000个细胞/ml，或高于约150,000个细胞/ml。
49.如权利要求29-48中任一项所述的方法，其中所述患者在施用后血小板计数低于约67,000个细胞/ml，或低于约100,000个细胞/ml，或低于约150,000个细胞/ml，并且监测约1-8周或直到血小板计数增加到约67,000个细胞/ml，或高于约100,000个细胞/ml，或高于约150,000个细胞/ml。
50.如权利要求29-49中任一项所述的方法，其中所述患者在施用后血小板计数低于约67,000个细胞/ml，并用血小板输注治疗。
51.如权利要求29-50中任一项所述的方法，其中所述患者在施用前没有血小板减少。
52.如权利要求29-51中任一项所述的方法，其中所述患者在施用后出现血小板减少，并被监测约1-8周或直到患者没有血小板减少。
53.如权利要求29-52中任一项所述的方法，其中所述患者在施用后出现血小板减少，并且用血小板输注治疗。
54.如权利要求29-53中任一项所述的方法，其中在施用所述病毒载体前，所述患者具有少于约0.176ug/ml的肌钙蛋白I水平。
55.如权利要求29-54中任一项所述的方法，其中在施用所述病毒载体后监测所述患者的肌钙蛋白I的水平。
56.如权利要求54或权利要求55所述的方法，其中在施用后进行心脏监测，直到所述患者的肌钙蛋白I水平低于约0.176ug/ml。
57.如权利要求29-56中任一项所述的方法，其中所述患者在施用前肝功能正常。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述患者在施用前的肝转氨酶水平低于约8-40U/L。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述肝转氨酶选自丙氨酸转氨酶(AST)、天冬氨酸转氨酶(ALT)及其组合。
60.如权利要求29-59中任一项所述的方法，其中所述患者在施用前的胆红素水平低于3.0mg/dL、肌酐水平低于1.8mg/dL、Hgb水平在8-18g/dL之间、和/或白细胞计数少于约20000个/mm3。
61.如权利要求29-60中任一项所述的方法，其中所述病毒载体在Tris缓冲盐水中施用。
62.如权利要求29-61中任一项所述的方法，其中所述病毒载体在约5-20mL/kg、约10-20mL/kg或约5.5-6.5mL/kg的Tris缓冲盐水中施用。
63.如权利要求29-62中任一项所述的方法，其中经约45-75分钟输注所述病毒载体。
64.如权利要求29-63中任一项所述的方法，其中经约60分钟输注所述病毒载体。
65.如权利要求63或权利要求64所述的方法，其中所述输注包括注射泵。
66.如权利要求29-65中任一项所述的方法，其中在施用所述病毒载体前至少24小时给所述患者施用口服类固醇。
67.如权利要求29-66中任一项所述的方法，其中在施用所述病毒载体后给所述患者施用口服类固醇至少30天。
68.如权利要求67所述的方法，其中所述口服类固醇每日施用一次。
69.如权利要求67所述的方法，其中所述口服类固醇每日施用两次。
70.如权利要求66-69中任一项所述的方法，其中在施用所述病毒载体后监测所述患者的ALT和/或AST的升高水平，并且其中在30天后继续施用所述口服类固醇，直到AST和/或ALT水平低于正常上限的两倍或低于约120IU/L。
71.如权利要求66-70中任一项所述的方法，其中给所述患者施用口服类固醇直到AST和/或ALT水平低于正常上限的两倍或低于约120IU/L。
72.如权利要求66-70中任一项所述的方法，其中所述口服类固醇以约1mg/kg的剂量施用。
73.如权利要求66-71中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在AST和ALT低于正常上限的两倍或低于约120IU/L后，渐减所述口服类固醇施用。
74.如权利要求73所述的方法，其中所述渐减包括阶梯式递增至0.5mg/kg/天，持续2周，然后是0.25mg/kg/天，再持续2周。
75.如权利要求66-73中任一项所述的方法，所述方法包括以约1mg/kg的剂量施用所述口服类固醇30天，并且然后渐减降至0.5mg/kg/天，持续2周，然后是0.25mg/kg/天，再持续2周。
76.如权利要求66-75中任一项所述的方法，其中所述口服类固醇是泼尼松龙或等效物。
77.如权利要求29-76中任一项所述的方法，所述方法包括给所述患者施用肌肉增强剂或神经保护剂。
78.如权利要求29-77中任一项所述的方法，所述方法包括给所述患者施用靶向SMN的反义寡核苷酸。
79.如权利要求29-78中任一项所述的方法，所述方法包括给所述患者施用努辛生。
80.如权利要求29-79中任一项所述的方法，所述方法包括给所述患者施用司达鲁单抗。
81.如权利要求29-80中任一项所述的方法，其中使用CHOP-INTEND量表来确定功效。
82.一种治疗具有I型脊髓性肌萎缩(SMA)、具有或没有疾病发作的儿科患者的方法，所述方法包括给所述患者施用包含如权利要求2或5-28中任一项所述的腺相关病毒(AAV)载体的组合物或配制品。
83.一种治疗有需要的患者的雷特综合征的方法，所述方法包括通过鞘内或静脉内途径给所述患者施用如权利要求3或8-17中任一项所述的组合物。
84.一种治疗有需要患者的肌萎缩侧索硬化症(ALS)的方法，所述方法包括通过鞘内或静脉内途径给所述患者施用如权利要求4或8-17中任一项所述的组合物。
85.一种治疗患有I型SMA的患者的方法，所述方法包括：
a.确定所述患者的体重；
b.获得包含AAV9病毒载体药物组合物小瓶的试剂盒，其中所述试剂盒包含以下数量的小瓶：
c.其中每个小瓶中的病毒载体浓度为约2.0x1013vg/mL；
d.其中所述AAV9病毒载体包含编码SMN蛋白的多核苷酸；以及
e.将来自所述小瓶的AAV9病毒载体施用给所述患者。
86.如权利要求85所述的方法，其中所述AAV9病毒载体包含突变的AAV2ITR、鸡β-肌动蛋白(CB)启动子、巨细胞病毒(CMV)即刻/早期增强子、经修饰的SV40晚期16s内含子、牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号和AAV2ITR。
87.如权利要求85或86所述的方法，其中所述多核苷酸编码SEQIDNO:2的SMN蛋白。
88.如权利要求85-87中任一项所述的方法，其中所述AAV9病毒载体包含SEQIDNO:1。
89.如权利要求85-88中任一项所述的方法，其中所述AAV病毒载体以约1.0x1014-2.5x1014vg/kg的剂量通过输注施用。
90.如权利要求85-89中任一项所述的方法，其中所述AAV病毒载体以约1.1x1014vg/kg的剂量通过输注施用。
91.如权利要求89或权利要求90所述的方法，其中经约45-70分钟输注所述病毒载体。
92.如权利要求89-91中任一项所述的方法，其中经约60分钟输注所述病毒载体。
93.如权利要求89-92中任一项所述的方法，其中所述输注包括注射泵。
94.如权利要求85-93中任一项所述的方法，其中使用ddPCR测量病毒载体基因组的数量。
95.如权利要求85-94中任一项所述的方法，其中通过ddPCR测量AAV9病毒载体的剂量效价。
96.如权利要求85-95中任一项所述的方法，所述方法包括施用以下剂量体积：
患者体重范围(kg)
剂量体积(mL)
2.6-3.0
16.5
3.1-3.5
19.3
3.6-4.0
22.0
4.1-4.5
24.8
4.6-5.0
27.5
5.1-5.5
30.3
5.6-6.0
33.0
6.1-6.5
35.8
6.6-7.0
38.5
7.1-7.5
41.3
7.6-8.0
44.0
8.1-8.5
46.8。
97.一种用于治疗患有I型脊髓性肌萎缩(SMA)的患者的试剂盒，所述试剂盒包含含有如权利要求2或5-17中任一项所述的组合物或如权利要求18-28中任一项所述的配制品的小瓶。
98.一种试剂盒，所述试剂盒包含含有约5.5mL或约8.3mLAAV9病毒载体的小瓶，所述AAV9病毒载体包含编码运动神经元存活(SMN)蛋白的多核苷酸，并以约2.0x1013vg/mL的浓度配制在20mMTris、1mMMgCl2、200mMNaCl、0.005％w/v泊洛沙姆188中，pH7.7-8.3，例如约8.0。
99.如权利要求98所述的试剂盒，其中所述AAV9病毒载体包含突变的AAV2ITR、鸡β-肌动蛋白(CB)启动子、巨细胞病毒(CMV)即刻/早期增强子、经修饰的SV40晚期16s内含子、牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号和AAV2ITR。
100.如权利要求98或权利要求99所述的试剂盒，其中所述多核苷酸编码SEQIDNO:2的SMN蛋白。
101.如权利要求98-100中任一项所述的试剂盒，其中所述AAV9病毒载体包含SEQIDNO:1。
102.如权利要求98-101中任一项所述的试剂盒，其中使用ddPCR测量病毒载体基因组的数量。
103.一种治疗I型SMA的方法，所述方法包括通过静脉内输注给有需要的患者施用一定体积的如权利要求2或5-17中任一项所述的组合物或如权利要求18-28中任一项所述的配制品。
104.如权利要求103所述的方法，其中如果所述患者的体重为2.6-3.0kg，所述体积为16.5mL。
105.如权利要求103所述的方法，其中如果所述患者的体重为3.1-3.5kg，所述体积为19.3mL。
106.如权利要求103所述的方法，其中如果所述患者的体重为3.6-4.0kg，所述体积为22.0mL。
107.如权利要求103所述的方法，其中如果所述患者的体重为4.1-4.5kg，所述体积为24.8mL。
108.如权利要求103所述的方法，其中如果所述患者的体重为4.6-5.0kg，所述体积为27.5mL。
109.如权利要求103所述的方法，其中如果所述患者的体重为5.1-5.5kg，所述体积为30.3mL。
110.如权利要求103所述的方法，其中如果所述患者的体重为5.6-6.0kg，所述体积为33.0mL。
111.如权利要求103所述的方法，其中如果所述患者的体重为6.1-6.5kg，所述体积为35.8mL。
112.如权利要求103所述的方法，其中如果所述患者的体重为6.6-7.0kg，所述体积为38.5mL。
113.如权利要求103所述的方法，其中如果所述患者的体重为7.1-7.5kg，所述体积为41.3mL。
114.如权利要求103所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：B·K·卡斯帕，J·M·哈特菲尔德，J·巴莱迪耶，A·A·卡斯帕，R·E·霍奇，
申请(专利权)人：阿维克斯公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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