用于生产AAV颗粒的载体制造技术

本发明专利技术涉及用于生产腺相关病毒(AAV)颗粒的质粒的生产。特别地，本发明专利技术提供包含cap基因和rep基因的核酸分子，其中，cap基因和rep基因都与相同的启动子可操作地相关联。本发明专利技术还提供包含本发明专利技术的核酸分子的宿主细胞及其使用方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于生产AAV颗粒的载体
本专利技术涉及用于生产腺相关病毒(AAV)颗粒的质粒的生产。特别地，本专利技术提供包含cap基因和rep基因的核酸分子，其中cap基因和rep基因都与相同的启动子可操作地相关联。本专利技术还提供包含本专利技术的核酸分子的宿主细胞及其使用方法。
技术介绍
AAV载体是从属于细小病毒科的单链DNA病毒开发而来的。该病毒能够感染广泛范围的宿主细胞，所述宿主细胞包括分裂细胞和非分裂细胞两者。另外，该病毒是在大多数患者中仅产生有限的免疫应答的非致病性病毒。AAV基因组包含两个基因，所述两个基因各自编码多个开放阅读框(ORF)：rep基因编码病毒基因组的AAV生命周期和位点特异性整合所需的非结构蛋白；并且cap基因编码结构衣壳蛋白。另外，这两个基因的侧翼是由145个碱基组成的反向末端重复(ITR)序列，该反向末端重复序列具有形成发夹结构的能力。这些发夹序列是第二DNA链的非引发酶依赖性合成以及病毒DNA整合到宿主细胞基因组中所需的。为了消除病毒的任何整合能力，重组AAV载体从病毒基因组的DNA中去除了rep和cap。为了产生这种载体，将所需的转基因与用以驱动转基因转录的启动子一起插入反向末端重复(ITR)之间；并且在第二质粒中反式提供rep基因和cap基因。也使用了提供辅助基因比如腺病毒E4、E2a和VA基因的第三质粒。所有三种质粒随后被转染到培养的“包装”细胞(比如HEK293)中。在过去的几年中，AAV载体已经作为一种非常有用和有希望的基因递送模式出现。这是由于这些载体具有以下特性：-AAV是小型无包膜病毒，并且AAV仅具有两种天然基因(rep和cap)。因此，AAV可以被容易地操纵以开发用于不同基因疗法的载体。-AAV颗粒不易被剪切力、酶或溶剂降解。这有利于这些病毒载体的容易纯化和最终配制。-AAV是非致病性的并且具有低免疫原性。这些载体的使用进一步降低了不良炎症反应的风险。与其他病毒载体(比如慢病毒、疱疹病毒和腺病毒)不同，AAV是无害的并且不被认为是引起任何人类疾病的原因。-可以使用AAV载体将高达4000bp的遗传序列递送给患者。-尽管野生型AAV载体已显示有时会在人类19号染色体上插入遗传物质，但是通常通过将rep基因和cap基因从病毒基因组中去除来消除大多数AAV载体的该特性。在这种情况下，病毒以附加形式保留在宿主细胞中。这些附加体在非分裂细胞中保持完整，而在分裂细胞中这些附加体在细胞分裂期间丢失。
技术实现思路
然而，本专利技术的专利技术人已经认识到，可以通过优化在载体生产过程中存在的Rep蛋白和Cap蛋白的比例和量来改善用于生产AAV载体的方法。因此，本专利技术的目的是提供一种核酸分子，该核酸分子包含在单个启动子控制下的cap基因和rep基因；由此，Cap多肽和Rep多肽在同一mRNA中编码。cap基因的翻译将通过在核糖体处将甲基鸟苷酸cap(m7G)对接在capmRNA的5'末端处来启动。rep基因的翻译将通过将核糖体对接在位于rep基因上游的内部核糖体进入位点(IRES)处来启动。通过使用本专利技术的核酸分子，可以获得更高的病毒效价。在本专利技术的一些实施方式中，所述IRES替代野生型p5启动子。去除p5启动子的另一优势是，在野生型病毒中，p5启动子被E2ADNA结合蛋白(DBP)结合并激活。因此，去除p5启动子意味着不需要E2A基因(例如，在辅助质粒中)来产生病毒颗粒。在一个实施方式中，本专利技术提供一种核酸分子，其包含：(i)启动子，(ii)cap基因，以及(iii)rep基因，按照以上5’-3’的顺序，其中，所述cap基因和所述rep基因都与所述启动子可操作地相关联，并且其中，所述rep基因也与IRES可操作地相关联。本专利技术还提供一种核酸分子，其包含：(i)cap基因，以及(ii)rep基因，按照以上5’-3’的顺序，其中，所述rep基因与IRES可操作地相关联。所述核酸分子可以是DNA或RNA，优选是DNA。所述核酸分子可以是单链或双链的，优选是双链的。本专利技术的核酸分子包含rep基因。如本文中所使用的，术语“rep基因”是指编码一个或多个开放阅读框(ORF)的基因，其中，所述ORF中的每个ORF均编码AAVRep非结构蛋白或其变体或衍生物。这些AAVRep非结构蛋白(或其变体或衍生物)参与AAV基因组复制和/或AAV基因组包装。图1示出了野生型AAV基因组的结构，其说明了野生型rep基因和cap基因的组织。野生型rep基因包含三个启动子：p5、p19和p40。从p5和p19可以生产不同长度的两个重叠的信使核糖核酸(mRNA)。这些mRNA中的每个mRNA均包含内含子，该内含子可以使用单个剪接供体位点和两个不同的剪接受体位点将其剪接掉或不剪接掉。因此可以形成六个不同的mRNA，其中，只有四个是功能性的。未能去除内含子的两个mRNA(一个从p5转录，而一个从p19转录)通读共享终止子序列并且分别编码Rep78和Rep52。去除内含子并使用最5’端剪接受体位点不会导致产生任何功能性Rep蛋白-不能产生正确的Rep68蛋白或Rep40蛋白，这是因为序列的其余部分的框架发生了移位，也不会产生Rep78或Rep52的正确的C末端，这是因为它们的终止子被剪接掉。相反，去除内含子并使用3’剪接受体将会包括Rep68和Rep40的正确C末端，同时剪接掉Rep78和Rep52的终止子。因此，唯一的功能性剪接避免了将内含子完全剪接掉(产生Rep78和Rep52)或者使用3’剪接受体(以产生Rep68和Rep40)。因此，可以从这些启动子合成具有重叠序列的四个不同的功能性Rep蛋白。在野生型rep基因中，p40启动子位于3’端处。在野生型AAV基因组中，Cap蛋白(VP1、VP2和VP3)的转录从该启动子启动。四种野生型Rep蛋白是Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。因此，野生型rep基因是一种编码四种Rep蛋白Rep78、Rep68、Rep52和Rep40的基因。Rep78和Rep68可以特异性结合由ITR形成的发夹，并且可以在发夹内的特定区域(即，末端解离位点)处对发夹进行切割。在野生型病毒中，Rep78和Rep68也是AAV基因组的AAV特异性整合所必需的。Rep78和Rep68在野生型病毒中在p5启动子的控制下转录，并且Rep78与Rep68之间的差异反映了通过剪接而去除(或不去除)内含子，因此它们具有不同的C末端蛋白组成。Rep52和Rep40参与基因组包装。Rep52和Rep40在野生型病毒中在p19启动子的控制下转录，并且Rep52与Rep40之间的差异反映了通过剪接而去除(或不去除)内含子，因此它们具有不同的C末端蛋白组成。所有四种Rep蛋白都结合ATP并且具有解旋酶活性。它们上调p40启动子的转录，但下调p5启动子和p19启动子的转录。如本文中所使用的，术语“rep基因”包含野生型本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核酸分子，其包含：/n(i)启动子，/n(ii)cap基因，以及/n(iii)rep基因，/n按照以上5’→3’的顺序，其中，所述cap基因和所述rep基因都与所述启动子可操作地相关联，并且其中，所述rep基因也与IRES可操作地相关联。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180119 GB 1800903.51.一种核酸分子，其包含：
(i)启动子，
(ii)cap基因，以及
(iii)rep基因，
按照以上5’→3’的顺序，其中，所述cap基因和所述rep基因都与所述启动子可操作地相关联，并且其中，所述rep基因也与IRES可操作地相关联。


2.根据权利要求1所述的核酸分子，其中，
(a)所述rep基因编码Rep78、Rep68、Rep52和Rep40；或者
(b)所述rep基因仅编码Rep78、Rep68、Rep52和Rep40中的一者、两者或三者。


3.根据权利要求1所述的核酸分子，其中，所述rep基因：
(a)编码Rep78和Rep52，但不编码Rep68或Rep40；
(b)编码Rep68和Rep40，但不编码Rep78或Rep52；
(c)编码Rep68和Rep52，但不编码Rep78或Rep40；或者
(d)编码Rep78和Rep40，但不编码Rep68或Rep52。


4.根据前述权利要求中的任一项所述的核酸分子，其中，Rep52和/或Rep40不从所述启动子转录。


5.根据权利要求4所述的核酸分子，其中，Rep52和/或Rep40从p19启动子转录。


6.根据前述权利要求中的任一项所述的核酸分子，其中，所述rep基因和所述cap基因的核苷酸序列来自或衍生自AAVrep基因或AAVcap基因，优选来自或衍生自AAV血清型2rep基因或AAV血清型2cap基因。


7.根据前述权利要求中的任一项所述的核酸分子，其中，所述启动子是巨细胞病毒即刻早期(CMV)启动子或从所述巨细胞病毒即刻早期(CMV)启动子衍生的启动子。


8.根据权利要求1至6中的任一项所述的核酸分子，其中，所述启动子是诱导型启动子。


9.根据前述权利要求中的任一项所述的核酸分子，其中，所述IRES是小核糖核酸病毒IRES(脑心肌炎病毒，EMCVIRES)或口疮病毒IRES(口蹄疫病毒，FMDVIRES)或其衍生物。


10.一种RNA分子，其包含：
(i)cap基因，以及
(ii)rep基因，
按照以上5’→3’的顺序，其中，所述rep基因与IRES可操作地相关联。


11.一种包含根据权利要求1至9中的任一项所述的核酸分子的质粒或载...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·卡伍德，A·S·布雷，T·A·佩恩，
申请(专利权)人：牛津遗传学有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB