基于单质粒拯救系统的塞内卡病毒感染性克隆及构建方法和应用技术方案

本发明专利技术提供了一种针对正链RNA病毒的单质粒拯救系统及基于该系统的塞内卡病毒感染性克隆及构建方法和应用，涉及基因工程技术领域。本发明专利技术提供了针对正链RNA病毒的单质粒拯救系统以及利用该拯救系统可定向设计SVA反向重组疫苗及构建SVA定向突变毒株在病毒基因功能、病毒变异及致病机制等研究中的应用。本发明专利技术利用聚合酶I和聚合酶II启动子、终止子、核酶等元件构建的单质粒塞内卡病毒拯救系统，实现了在质粒水平上编辑病毒基因组，为病毒定向设计、构建和拯救提供了技术平台。

【技术实现步骤摘要】
基于单质粒拯救系统的塞内卡病毒感染性克隆及构建方法和应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及基于单质粒拯救系统的塞内卡病毒感染性克隆及构建方法和应用。
技术介绍
塞内卡病毒A(SenecavirusA,SVA)，也称塞内卡病毒(Senecavirus)、塞尼卡谷病毒(Senecavalleyvirus,SVV)，属于小RNA病毒科(Picornaviridae)塞内卡病毒属(Senecavirus)，也是该属的唯一成员。该病毒感染猪能够引起猪的原发性水泡病，与口蹄疫、猪水泡病和水泡性口炎等引起的临床症状难以区分。SVA感染后能引起断奶仔猪、保育、育肥和繁殖的各年龄段的猪发生水泡性病变，同时伴随跛行、发热、厌食、嗜睡等临床症状，新生仔猪除了上述症状外，还可能存在持续的腹泻、脱水等症状，甚至会突然死亡。塞内卡病毒先后在美国、加拿大、巴西、哥伦比亚、中国、泰国等多个国家引发疫情，2015年传入我国，首次在广东出现疫情，并迅速扩散，在福建、广西、湖北、河南、河北、山东、辽宁等省均引起大量猪场发病，传播速度和致病力均比此前报道的有所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种针对正链RNA病毒的单质粒拯救系统，其特征在于，所述单质粒拯救系统为包含有正链RNA病毒核酸序列的真核转录质粒，所述真核转录质粒在病毒核酸序列的5'端上游含人巨细胞病毒RNA聚合酶II启动子、鼠源RNA聚合酶I启动子和核酶序列；在病毒核酸序列的3'端下游含核酶、鼠源聚合酶终止子I和聚合酶终止子II序列；/n所述正链RNA病毒包括塞内卡病毒。/n

【技术特征摘要】
1.一种针对正链RNA病毒的单质粒拯救系统，其特征在于，所述单质粒拯救系统为包含有正链RNA病毒核酸序列的真核转录质粒，所述真核转录质粒在病毒核酸序列的5'端上游含人巨细胞病毒RNA聚合酶II启动子、鼠源RNA聚合酶I启动子和核酶序列；在病毒核酸序列的3'端下游含核酶、鼠源聚合酶终止子I和聚合酶终止子II序列；
所述正链RNA病毒包括塞内卡病毒。


2.一种塞内卡病毒全长感染性克隆的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以SVV/FJ/001株的cDNA为模板，用特异性引物对扩增SVV/FJ/001株的A基因；所述特异性引物对包括上游引物和下游引物SVA-AR；所述上游引物包括SVA-1F0和SVA-1F，所述上游引物SVA-1F0的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述上游引物SVA-1F的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述下游引物SVA-AR的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；
(2)以SVV/FJ/001株的cDNA为模板，用特异性引物对扩增SVV/FJ/001株的B基因，所述特异性引物对包括上游引物SVA-BF和下游引物SVA-2R，所述上游引物SVA-BF的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，所述下游引物SVA-2R的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；
(3)将步骤(1)和步骤(2)扩增得到的A基因和B基因分别与pMD20T载体连接，转化JM109感受态细胞，得质粒PMD-A和PMD-B；
(4)将质粒PMD-A用PacI和NheI双酶切、质粒PMD-B用NheI和NotI双酶切后，回收目的片...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑海学，杨帆，朱紫祥，曹伟军，田宏，张克山，魏婷，张伟，郑敏，党文，马旭升，李丹，茹毅，何继军，郭建宏，刘湘涛，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62