核酸分子及其用途制造技术

本公开提供了包含第一反向末端重复(ITR)、第二ITR和编码miRNA和/或治疗性蛋白质的基因盒的核酸分子。在某些实施方案中，该治疗性蛋白质包含凝血因子，例如，FVIII多肽、FIX多肽，或其片段。在一些实施方案中，该第一ITR和/或该第二ITR是非腺相关病毒(AAV)的ITR。本公开还提供了治疗出血性病症(如血友病)的方法，该方法包括向受试者施用该核酸分子或由其编码的多肽。

Nucleic acid molecule and its application

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】核酸分子及其用途电子提交的序列表的引用以ASCII文本文件电子提交的的序列表的内容(名称：4159_493PC01_ST25；大小：434,561字节；和创建日期：2018年8月9日)通过提述以其整体并入本文。专利技术背景基因疗法提供了一种持久治疗多种疾病的方式。在过去，基因疗法通常依赖于病毒的使用。出于此目的可选择许多病毒药剂，每种病毒药剂具有将使其或多或少地适合于基因疗法的独特性质。Zhou等,AdvDrugDelivRev.106(PtA):3-26,2016。然而，一些病毒载体的非期望的性质(包括其免疫原性或引起癌症的倾向)已经导致临床安全性担忧，并且直到最近，它们当前在临床上的应用限于某些应用，例如疫苗和溶瘤策略。Cotter等,FrontBiosci.10:1098-105(2005)。腺相关病毒(AAV)是研究最常见的基因疗法载体之一。AAV是围绕并保护约4.8千碱基(kb)的小的单链DNA基因组的蛋白质壳。Naso等,BioDrugs,31(4):317-334,2017。AAV属于细小病毒科，并且依赖于与其它病毒(主要是腺病毒)共同感染，以便复制。同上引用。它的单链基因组含有三个基因：Rep(复制)、Cap(衣壳)和aap(组装)。同上引用。这些编码序列的侧翼是基因组复制和包装所需的反向末端重复(ITR)。同上引用。两个顺式作用AAVITR的长度为大约145个核苷酸，其由回文序列中断，这些回文序列可折叠成T形发夹结构，所述发夹结构在DNA复制起始过程中充当引物。然而，使用常规的AAV作为基因递送载体已经导致一些缺点。主要缺点之一与AAV的约4.5kb的异源DNA的有限病毒包装能力有关。(Dong等,HumGeneTher.7(17):2101-12,1996)。此外，AAV载体的施用可诱导人类中的免疫应答。尽管已显示AAV的免疫原性低于一些其它病毒(即腺病毒)，但衣壳蛋白可以触发人类免疫系统的多种组分。参见Naso等,2017。AAV是人类群体中的常见病毒，且大多数人已经被暴露于AAV，因此，大多数人已经针对他们先前被暴露的特定变体产生了免疫应答。这种预先存在的适应性应答可包括NAb和T细胞，所述NAb和T细胞可降低随后再次感染AAV和/或消除已被转导的细胞的临床效果，这使原先存在抗AAV免疫力的患者对基于AVV的基因疗法治疗不适格。无论是局部施用还是全身性施用，该病毒都将被视为一种外来蛋白质，因此，适应性免疫系统将试图消除它。此外，当第一次AAV治疗未能达到治疗性功效水平时，由AAV治疗诱导的抗AAV中和抗体阻碍AAV的重复治疗。此外，证据表明，AAVITR的T形发夹环容易受到结合AAVITR的T形发夹结构的宿主细胞蛋白质/蛋白质复合物的抑制。参见,例如，Zhou等,ScientificReports7:5432(2017年7月14日)。因此，本领域中需要在体外和体内环境中有效且持续表达靶序列，例如，治疗性蛋白质和/或miRNA,同时避免现有AAV载体技术的一些意外后果和局限性。专利技术概述本公开的一方面涉及一种核酸分子，其包含第一反向末端重复(ITR)、第二ITR和编码治疗性蛋白质的基因盒；其中所述第一ITR和/或所述第二ITR是非腺相关病毒(非AAV)的ITR，其中所述基因盒位于所述第一ITR和所述第二ITR之间，且其中所述治疗性蛋白质包含凝血因子。在一些实施方案中，所述非AAV选自病毒科细小病毒科的成员及其任何组合。在一些实施方案中，所述第一ITR是非AAV的ITR且所述第二ITR是腺相关病毒(AAV)的ITR，或其中所述第一ITR是AAV的ITR且所述第二ITR是非AAV的ITR。在其它实施方案中，所述第一ITR和所述第二ITR是非AAV的ITR。在一些实施方案中，所述第一ITR和所述第二ITR是相同的。在一些实施方案中，所述第一ITR和/或所述第二ITR包含回文序列，该回文序列是不间断的。在其它实施方案中，所述第一ITR和/或所述第二ITR包含回文序列，该回文序列是间断的。在一些实施方案中，所述核酸分子中的非AAV是病毒科细小病毒科的成员。在一些实施方案中，所述病毒科细小病毒科的成员选自下组：博卡病毒属(Bocavirus)、依赖病毒属(Dependovirus)、红病毒属(Erythrovirus)、貂阿留申病毒属(Amdovirus)、细小病毒属(Parvovirus)、浓核病毒属(Densovirus)、重复病毒属(Iteravirus)、康特拉病毒属(Contravirus)、Aveparvovirus、Copiparvovirus、原细小病毒属(Protoparvovirus)、四细小病毒属(Tetraparvovirus)、双义浓核病毒属(Ambidensovirus)、短小浓核病毒属(Brevidensovirus)、肝胰浓核病毒属(Hepandensovirus)、对虾浓核病毒属(Penstyldensovirus)及其任何组合。在一些实施方案中，所述病毒科细小病毒科的成员是红病毒属细小病毒B19(人类病毒)。在一些实施方案中，所述病毒科细小病毒科的成员是番鸭细小病毒(Muscovyduckparvovirus，(MDPV))株。在一些实施方案中，所述MDPV株是减毒的FZ91-30。在一些实施方案中，所述MDPV株是致病性YY。在又一些实施方案中，依赖细小病毒(Dependoparvovirus)是依赖病毒属鹅细小病毒(GPV)株。在一些实施方案中，所述GPV株是减毒的82-0321V。在一些实施方案中，所述GPV株是致病性B。在一些实施方案中，所述病毒科细小病毒科的成员选自下组：猪细小病毒(U44978)、小鼠微小病毒(U34256)、犬细小病毒(M19296)、水貂肠炎病毒(D00765)及其任何组合。在一些实施方案中，所述核酸分子进一步包含启动子。在一些实施方案中，所述启动子是组织特异性启动子。在一些实施方案中，所述启动子驱动所述治疗性蛋白质在肝细胞、内皮细胞、肌肉细胞、窦状细胞或其任何组合中的表达。在一些实施方案中，所述启动子位于编码所述凝血因子的核酸序列的5'。在一些实施方案中，所述启动子选自下组：小鼠甲状腺素启动子(mTTR)、内源性人因子VIII启动子(F8)、人α-1-抗胰蛋白酶启动子(hAAT)、人白蛋白最小启动子、小鼠白蛋白启动子、Tristetraprolin(TTP)启动子、CASI启动子、CAG启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、α1-抗胰蛋白酶(AAT)、肌肉肌酸激酶(MCK)、肌球蛋白重链α(αMHC)、肌红蛋白(MB)、肌间线蛋白(DES)、SPc5-12、2R5Sc5-12、dMCK、tMCK、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子及其任何组合。在一些实施方案中，所述启动子包含TTP启动子。在一些实施方案中，所述核酸分子还包含内含子序列。在一些实施方案中，所述内含子序列位于编码所述凝血因子的核酸序列的5'。在一些实施方案中，所述内含子序列位于所述启动子的3'。在一些实施方案中，其中所述内含子序列包含合成的内含子序列。在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核酸分子，其包含第一反向末端重复(ITR)、第二ITR和基因盒；/n其中所述第一ITR和/或所述第二ITR是非腺相关病毒(非AAV)的ITR，其中所述基因盒位于所述第一ITR和所述第二ITR之间，且其中所述基因盒编码治疗性蛋白质、miRNA或治疗性蛋白质和miRNA二者。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170809 US 62/543,2971.一种核酸分子，其包含第一反向末端重复(ITR)、第二ITR和基因盒；
其中所述第一ITR和/或所述第二ITR是非腺相关病毒(非AAV)的ITR，其中所述基因盒位于所述第一ITR和所述第二ITR之间，且其中所述基因盒编码治疗性蛋白质、miRNA或治疗性蛋白质和miRNA二者。


2.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述治疗性蛋白质包含凝血因子。


3.根据权利要求1或2所述的核酸分子，其中所述非AAV选自病毒科细小病毒科(Parvoviridae)的成员。


4.根据权利要求1至3任一项所述的核酸分子，其中所述第一ITR和所述第二ITR是非AAV的ITR。


5.根据权利要求3或4所述的核酸分子，其中所述病毒科细小病毒科(Parvoviridae)的成员选自下组：博卡病毒属(Bocavirus)、依赖病毒属(Dependovirus)、红病毒属(Erythrovirus)、貂阿留申病毒属(Amdovirus)、细小病毒属(Parvovirus)、浓核病毒属(Densovirus)、重复病毒属(Iteravirus)、康特拉病毒属(Contravirus)、Aveparvovirus、Copiparvovirus、原细小病毒属(Protoparvovirus)、四细小病毒属(Tetraparvovirus)、双义浓核病毒属(Ambidensovirus)、短小浓核病毒属(Brevidensovirus)、肝胰浓核病毒属(Hepandensovirus)、对虾浓核病毒属(Penstyldensovirus)、番鸭细小病毒(Muscovyduckparvovirus,(MDPV))株、猪细小病毒属(porcineparvovirus)(U44978)、小鼠微小病毒(miceminutevirus)(U34256)、犬细小病毒属(canineparvovirus)(M19296)和水貂肠炎病毒(minkenteritisvirus)(D00765)。


6.根据权利要求3至5任一项所述的核酸分子，其中所述病毒科细小病毒科(Parvoviridae)的成员是红病毒属细小病毒B19(人类病毒)。


7.根据权利要求3至5任一项所述的核酸分子，其中所述病毒科细小病毒科是依赖病毒属鹅细小病毒(GPV)株。


8.根据权利要求1至7任一项所述的核酸分子，其进一步包含组织特异性启动子。


9.根据权利要求8所述的核酸分子，其中所述启动子驱动所述治疗性蛋白质在肝细胞、内皮细胞、肌肉细胞、窦状细胞或其任何组合中的表达。


10.根据权利要求8或9所述的核酸分子，其中所述启动子选自下组：小鼠甲状腺素启动子(mTTR)、内源性人因子VIII启动子(F8)、人α-1-抗胰蛋白酶启动子(hAAT)、人白蛋白最小启动子、小鼠白蛋白启动子、Tristetraprolin(TTP)启动子、CASI启动子、CAG启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、α1-抗胰蛋白酶(AAT)、肌肉肌酸激酶(MCK)、肌球蛋白重链α(αMHC)、肌红蛋白(MB)、肌间线蛋白(DES)、SPc5-12、2R5Sc5-12、dMCK、tMCK和磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。


11.根据权利要求1至10任一项所述的核酸分子，其中所述核苷酸序列进一步包含：
(a)内含子序列，
(b)转录后调控元件，
...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·谢列金，T·刘，S·帕塔罗约怀特，D·德尔格，R·T·彼得斯，J·刘，
申请(专利权)人：比奥维拉迪维治疗股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US