用于MECP2在Rett综合征中安全表达的自调节AAV载体制造技术

在一些方面，本公开涉及工程化转基因的组合物和方法。在一些实施方式中，本公开提供了包含MeCP2转基因的自调节重组核酸、病毒载体和药物组合物。在一些实施方式中，本公开所述的组合物和方法用于治疗与功能丧失突变相关的疾病和病症，例如Rett综合征。

Self regulated AAV vector for the safe expression of MeCP2 in Rett syndrome

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于MECP2在Rett综合征中安全表达的自调节AAV载体相关申请本申请要求2017年6月6日提交的美国临时申请号62/516,060基于35U.S.C.§119(e)的权益，通过引用将其内容整体并入本文。
技术介绍
Rett综合征是由MeCP2中功能丧失突变引起的神经疾病。已经观察到，MeCP2表达的出生后恢复在逆转存在于MeCP2小鼠中的一些表型是有效的，但是仍然存在安全性问题。另外，检查编码e1亚型的某些MeCP2载体的治疗效果的研究仅观察到Rett表型的部分拯救。这些研究通常集中于新生儿血管内(IV)或脑室内(ICV)递送，并且在一些情况下遇到致死性肝毒性和后肢紧扣。
技术实现思路
本公开的一些方面涉及下述发现：miRNA调节元件(MRE)(例如与基因表达负反馈环相关的miRNA结合位点和使转基因表达从非靶组织脱靶的miRNA结合位点)的某些组合使得能够在与正常蛋白功能相容的窄范围内进行可调的转基因表达并避免脱靶转基因毒性。因此，在一些实施方式中，本公开描述的组合物和方法可用于治疗与功能丧失突变相关的疾病和病症，例如与MECP2基因中的功能丧失突变相关的Rett综合征。因此，在一些方面，本公开提供了工程化转基因的方法，所述方法包括：选择细胞中编码第一产物的第一基因；选择细胞中编码第二产物的第二基因；确定第二产物的表达受细胞中的第一产物正调节；选择miRNA；确定miRNA的表达受细胞中的第二产物正调节；和工程化转基因以在细胞中表达具有编码第一产物的编码区和具有一个或多个miRNA结合位点的转录物。在一些方面，本公开提供了工程化转基因的方法，所述方法包括：选择细胞中编码第一产物的第一基因；选择miRNA，miRNA的表达受细胞中的第一产物正调节；和工程化表达转录物的转基因，所述转录物具有编码第一产物的编码区和包含一个或多个miRNA结合位点的3’-非编码区。在一些方面，本公开提供了工程化转基因的方法，所述方法包括：选择细胞中编码第一产物的第一基因；选择细胞中编码第二产物的第二基因；确定所述第二产物的表达受细胞中的第一产物正调节；选择miRNA；确定miRNA的表达受细胞中的第二产物正调节；和工程化转基因以在细胞中表达转录物，所述转录物具有编码第一产物的编码区和包含一个或多个miRNA结合位点的3’-非编码区。在一些方面，本公开提供了编码转录物的重组核酸，所述转录物具有i)编码蛋白的编码区和ii)两个或更多个miRNA结合位点，其中所述两个或更多个miRNA结合位点包含：至少一个第一miRNA结合位点，其对受靶组织细胞中的蛋白表达正调节的第一miRNA具有特异性；和至少一个第二miRNA结合位点，其对在非靶组织的细胞中表达的第二miRNA具有特异性，该表达独立于所述蛋白的表达。在一些方面，本公开提供了编码转录物的重组核酸，所述转录物具有编码人MeCP2蛋白或其功能片段的编码区和包含一个或多个miRNA结合位点的3’-非编码区，其中所述一个或多个miRNA结合位点包含：至少一个miRNA结合位点，其对负调节转录物的表达的miRNA具有特异性；和至少一个miRNA结合位点，其对抑制非靶组织中的转录物表达的miRNA具有特异性。在一些方面，本公开提供了编码转录物的重组核酸，所述转录物具有：编码人MeCP2或其功能片段的编码区，和包含一个或多个miRNA结合位点的3’-非编码区，其中转录物侧接腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)。在一些实施方式中，AAVITR是AAV2、AAV3、AAV4、AAV5或AAV6ITR。在一些实施方式中，AAVITR是AAV2ITR。在一些实施方式中，ITR是取代ITR功能的人工序列，例如WO/2016/172008中所公开的。在一些方面，本公开提供了包含如本公开所述的重组核酸的病毒载体。在一些实施方式中，病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体、慢病毒载体、疱疹病毒载体或杆状病毒载体。在一些方面，本公开提供了重组腺相关病毒(rAAV)，其包含：如本公开所述的重组核酸；至少一个腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)；和衣壳蛋白。在一些方面，本公开提供了用于蛋白的自调节表达的重组AAV(rAAV)载体，该rAAV载体包含经工程化以在靶组织的细胞中表达编码蛋白的转录物的核酸，其中该转录物包含至少一个第一miRNA结合位点，其对第一miRNA具有特异性，其中该第一miRNA的表达受细胞中蛋白表达的正调节。在一些方面，本公开提供了包含如本公开所述的重组核酸或如本公开所述的rAAV，和药学上可接受的赋形剂的组合物。在一些实施方式中，组合物被配制用于注射，例如全身注射(例如，静脉内注射)或鞘内注射。在一些实施方式中，第一产物是蛋白。在一些实施方式中，所述蛋白是MeCP2，例如MeCP2亚型e1或MeCP2亚型e2。在一些实施方式中，第一产物是miRNA或长非编码RNA。在一些实施方式中，第二产物是蛋白或核酸。在一些实施方式中，第二产物是骨衍生神经营养因子(BDNF)。在一些实施方式中，核酸是miRNA(例如miR-132)。在一些实施方式中，第一miRNA是miR-132。在一些实施方式中，至少一个对负调节转录物表达的miRNA具有特异性的miRNA结合位点包含miR-132结合位点，例如两个或三个miR-132结合位点。在一些实施方式中，至少一个miRNA结合位点(其对抑制非靶组织中转录物表达的miRNA具有特异性)包括miR-1结合位点、mir-122结合位点、或miR-1和miR-122结合位点。在一些实施方式中，至少一个对抑制非靶组织中转录物表达的miRNA具有特异性的miRNA结合位点包含三个miR-1结合位点(例如，3x-miR-1)和三个miR-122结合位点(例如，3x-miR-122)。在一些实施方式中，本公开所述的方法还包括工程化转录物的3’-非编码区以包含一个或多个脱靶miRNA的一个或多个结合位点的步骤。在一些实施方式中，一个或多个脱靶miRNA抑制转基因从肝脏、心脏、肺、肌肉、胰腺或免疫(例如，抗原呈递)细胞的表达。在一些实施方式中，一个或多个脱靶miRNA是miR-122，miR-1，或miR-122和miR-1。在一些实施方式中，一个或多个脱靶miRNA抑制转基因在免疫细胞如抗原呈递细胞(例如，树突细胞、巨噬细胞等)中的表达。在一些实施方式中，一个或多个脱靶miRNA是miR-15a、miR-16-1、miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1、miR-21、miR-29a、miR-29b、miR-29c、miR-30b、miR-31、miR-34a、miR-92a-1、miR-106a、miR-125a、miR-125b、miR-126、miR-142-3p、miR-146a、miR-150、miR-155、miR-181a、miR-223或miR-424。在一些实施方式中，一个或多个miRNA结合位点位于编码本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种工程化转基因的方法，所述方法包括：/n(a)选择细胞中编码第一产物的第一基因；/n(b)选择miRNA，该miRNA的表达受细胞中的第一产物正调节；和/n(c)工程化表达转录物的转基因，该转录物具有编码第一产物的编码区和包含一个或多个miRNA结合位点的3'-非编码区。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170606 US 62/516,0601.一种工程化转基因的方法，所述方法包括：
(a)选择细胞中编码第一产物的第一基因；
(b)选择miRNA，该miRNA的表达受细胞中的第一产物正调节；和
(c)工程化表达转录物的转基因，该转录物具有编码第一产物的编码区和包含一个或多个miRNA结合位点的3'-非编码区。


2.一种工程化转基因的方法，所述方法包括：
(a)选择细胞中编码第一产物的第一基因；
(b)选择细胞中编码第二产物的第二基因；
(c)确定第二产物的表达受细胞中的第一产物正调节；
(d)选择miRNA；
(e)确定miRNA的表达受细胞中的第二产物正调节；和，
(f)工程化转基因以在细胞中表达转录物，该转录物具有编码第一产物的编码区和包含一个或多个miRNA结合位点的3'-非编码区。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一产物是蛋白。


4.根据权利要求3所述的方法，其中，蛋白是MeCP2，任选地为MeCP2亚型e1或MeCP亚型e2。


5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其中第二产物是蛋白或核酸，任选地其中核酸是miRNA。


6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中miRNA是miR-132。


7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述方法还包括工程化转录物的3'-非编码区以包含一个或多个用于一个或多个脱靶miRNA的结合位点。


8.根据权利要求7所述的方法，其中一种或多种脱靶miRNA抑制转基因从肝脏、心脏、肺、肌肉、胰腺或抗原呈递细胞的表达。


9.根据权利要求7或8所述的方法，其中一种或多种脱靶miRNA是miR-122，miR-1，或miR-122和miR-1。


10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中工程化转基因的步骤包括将转基因插入载体中。


11.根据权利要求10所述的方法，其中载体是克隆载体、表达载体、质粒或病毒载体。


12.一种工程化转基因的方法，所述方法包括：
(a)选择细胞中编码第一产物的第一基因；
(b)选择miRNA，该miRNA的表达受细胞中的第一产物正调节；和
(c)工程化表达转录物的转基因，该转录物具有编码第一产物的编码区并具有一个或多个miRNA的结合位点。


13.一种工程化转基因的方法，所述方法包括：
(a)选择细胞中编码第一产物的第一基因；
(b)选择细胞中编码第二产物的第二基因；
(c)确定第二产物的表达受细胞中的第一产物正调节；
(d)选择miRNA；
(e)确定miRNA的表达受细胞中的第二产物正调节；和
(f)工程化转基因以在细胞中表达具有编码第一产物的编码区和具有一个或多个miRNA结合位点的转录物。


14.一种用于蛋白的自调节表达的重组AAV(rAAV)载体，该rAAV载体包含经工程化以在靶组织的细胞中表达编码该蛋白的转录物的核酸，其中转录物包含对第一miRNA特异的至少一个第一miRNA结合位点，其中该第一miRNA的表达受细胞中该蛋白表达正调节。


15.一种重组AAV，其包含携带权利要求14所述的rAAV载体的衣壳，其中衣壳包含促进靶组织的细胞的选择性转导的衣壳蛋白。


16.一种编码转录物的重组核酸，所述转录物具有i)编码蛋白的编码区域和ii)两个或更多个miRNA结合位点，其中两个或更多个miRNA结合位点包含：
(a)至少一个第一miRNA结合位点，其特异于受靶组织细胞中蛋白表达的正调节的第一miRNA；和
(b)至少一个第二miRNA结合位点，其特异于在非靶组织的细胞中表达的第二miRNA，该表达独立于蛋白的表达。


17.一种编码转录物的重组核酸，所述转录物具有编码人MeCP2蛋白或其功能片段的编码区和包含两个或更多个miRNA结合位点的3'-非编码区，其中两个或更多个miRNA结合位点包含：
(a)至少一个miRNA结合位点，其特异于负调节转录物表达的miRNA；和
(b)至少一个miRNA结合位点，其特异于抑制非靶组织细胞中转录物表达的miRNA。


18.根据权利要求17所述的重组核酸，其中编码区编码MeCP2亚型e1。


19.根据权利要求17或18所述的重组核酸，其特征在于，人MeCP2包含SEQIDNO：1所示的序列。


20.根据权利要求17至19中任一项所述的重组核酸，其中特异于负调节转录物表达的miRNA的至少一个miRNA结合位点包括miR-132结合位点，任选地其中至少一个miRNA结合位点是两个或三个miR-132结合位点。


21.根据权利要求17至20中任一项所述的重组核酸，其中特异于抑制转录物在非靶组织中表达的miRNA的至少一个miRNA结合位点包括miR-1结合位点，mir-12...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·S·埃斯特维斯，高光平，M·R·格林，王丹，T·M·西蒙尼，
申请(专利权)人：马萨诸塞大学，
类型：发明
国别省市：美国;US