在昆虫细胞中改进的AAV衣壳产生制造技术

本发明专利技术涉及在昆虫细胞中腺相关病毒载体的产生。昆虫细胞因此包括编码腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白的第一核苷酸序列，其中用于翻译AAV VP1衣壳蛋白的起始密码子是AUG。VP1开放阅读框的上游设置选择性框外起始密码子，如此使得VP1蛋白的翻译起始被调整，即减少，以允许以良好化学计量比产生VP1:VP2:VP3，得到具有高效价的AAV。

Improved production of AAV capsid in insect cells

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】在昆虫细胞中改进的AAV衣壳产生
本专利技术涉及在昆虫细胞中腺相关病毒的产生以及涉及提供了改进的感染性的腺相关病毒。本专利技术还涉及关于腺相关病毒载体文库的手段和方法。专利技术背景腺相关病毒(AAV)可以被认为是最有希望用于人类基因疗法的病毒载体之一。AAV具有有效率地感染分裂人类细胞及非分裂人类细胞的能力，AAV病毒基因组整合到宿主细胞基因组中的单个染色体位点，并且最重要的是，即使AAV存在于许多人类中，其从未与任何疾病相关。鉴于这些优点，重组腺相关病毒(rAAV)正在对于B型血友病、恶性黑色素瘤、囊性纤维化和其他疾病的基因疗法临床试验中进行评估。在欧洲的大量临床试验和基因疗法药物的批准，如Alipogenetiparvovec(uniQure)，有望使AAV成为临床实践的主要内容。通常，对于重组AAV的产生系统主要有两类。一方面，有在哺乳动物细胞类型(如293细胞、COS细胞、HeLa细胞、KB细胞)中的常规产生系统，并且另一方面有使用昆虫细胞的产生系统。哺乳动物产生系统存在几个缺点，所述缺点可以包括每个细胞生成的rAAV颗粒数量有限(104的数量级的颗粒，(在Clark，2002，KidneyInt.61(Suppl.1):9–15中回顾)和繁琐的大规模制作。对于临床研究，可以需要超过1015的rAAV颗粒。为了产生这一数量的rAAV颗粒，将需要用大约1011个培养的人类293细胞来转染和培养，相当于5000个175-cm2培养瓶的细胞，这意味着转染多达1011个293细胞。因此，使用哺乳动物细胞培养系统大规模产生rAAV以获得用于临床试验的材料已经证明是有问题的，在大的商业规模下的产生可能更不可行。此外，一直有的风险是，在哺乳动物细胞培养中产生的用于临床用途的载体将被哺乳动物宿主细胞中存在的不期望的、可能致病的物质污染。为了克服哺乳动物产生系统的这些问题，已经使用昆虫细胞开发了AAV产生系统(Urabeetal.,2002,Hum.GeneTher.13:1935–1943；US20030148506及US20040197895)。来自野生型病毒的AAV野生型衣壳由约60种衣壳蛋白组成，即化学计量比约为1:1:10的VP1、VP2和VP3。不受理论的限制，认为化学计量比对于重组AAV获得好的效价(即好的转导)是重要的。在野生型病毒中，即在哺乳动物细胞中，取得了三种AAV衣壳蛋白(VP1、VP2和VP3)的约为1:1:10的化学计量比，这依赖于两个剪接受体位点的交替使用和对于VP2的ACG起始密码子较少最优利用的组合。然而，为了在昆虫细胞中产生AAV，有必要进行修饰，因为在哺乳动物细胞中出现的表达策略不会在昆虫细胞中复制。为了在昆虫细胞中获得衣壳蛋白改进的产生，Urabe等(2002,supra)使用了转录成单个多顺反子信使的构建体，所述单个多顺反子信使能够表达所有三种VP蛋白而不需要剪接，并且其中第一个翻译起始密码子被密码子ACG所取代。WO2007/046703公开了通过进一步优化昆虫细胞中AAV衣壳蛋白的比，进一步改进杆状病毒(baculovirus)产生的rAAV载体的感染性。Urabe等(J.Virol.,2006,80(4):1874-1885)报道了使用ACG作为VP1衣壳蛋白的起始密码子在杆状病毒系统中产生的AAV5颗粒具有差的转导效率或效价，并且与具有从ACG起始密码子表达VP1的AAV2相反，将AAV5VP1编码序列中的+4位突变为G残基没有提高感染性。Urabe等构建了嵌合AAV2/5VP1蛋白，其中AAV5VP1的至少49个氨基酸的N端部分被AAV2VP1的相应部分所取代，这改进了病毒体的转导性质。在又一方法中，通过在AAV衣壳编码序列中在次优(非ATG)翻译起始密码子和编码氨基酸残基(其对应于野生型衣壳氨基酸序列第2位的氨基酸残基)的密码子之间插入一个或多个氨基酸残基，提高了AAV衣壳蛋白的表达(Lubelski等人，WO2015137802)。尽管改进了用于制作用于医学治疗中的AAV基因疗法载体的衣壳的基于昆虫细胞的产生，仍需要进一步改进AAV衣壳产生，并且提供新方法以选择用于在昆虫细胞中表达的改进的AAV衣壳构建体。
技术实现思路
专利技术简述本专利技术者惊奇地发现，AAV衣壳可以在昆虫细胞中由表达构建体有效率地产生，该表达构建体编码来自重叠阅读框的VP1、VP2和VP3蛋白的转录本，其中VP1是从AUG起始密码子翻译的。含有ATG起始密码子的现有技术的构建体不产生像野生型AAV中观察到的约1:1:10的VP1:VP2:VP3比，并且因此，不受理论的限制，不会产生有效价的AAV。本专利技术中鉴定的表达构建体允许在昆虫细胞中有效率的产生大量用于医学治疗的高效价AAV基因疗法载体。如果关于效价和数量相对于从选择性(alternative)起始密码子(如CTG或GTG)产生的AAV基因疗法载体没有改进，这样的载体至少是相似的(见图4)。因此，本专利技术的构建体含有在VP1ATG起始密码子5’的额外框外起始密码子，所述额外框外起始密码子明显导致在VP1起始密码子翻译起始的减少，这允许翻译足量的VP1、VP2和VP3。不受理论的限制，这样的构建体可以允许VP1、VP2和VP3氨基酸序列的表达，因为它们是在野生型病毒中发现的。如示例所示，通过使用用于昆虫细胞的AAV衣壳表达构建体文库来鉴定这样的构建体。选择构建体，其首先需要在昆虫细胞中高度有效率的产生AAV衣壳，并且其次需要在选定的靶细胞上具有高度感染性。因此，本专利技术者还提供了高度有效率的选择方法，以提供具有改进的性质(例如改进的产生和/或改进的感染性)的AAV衣壳表达构建体。因此，在第一方面，在本专利技术提供了包括表达控制序列的核酸构建体，所述表达控制序列用于在昆虫细胞中表达包括开放阅读框的核苷酸序列，其中所述开放阅读框序列编码：i)腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白VP1、VP2和VP3；和ii)用于VP1的AUG翻译起始密码子；其中所述核苷酸序列包括在开放阅读框上游的选择性起始密码子，所述选择性起始密码子是在开放阅读框的框外。换句话说，所述选择性起始密码子优选是起始密码子上游的3N+1或3N+2个核苷酸。在另一方面，本专利技术提供了一种提供用于在昆虫细胞中的产生的编码细小病毒的衣壳蛋白的核酸构建体的方法，所述核酸构建体具有一种或多种改进的性质，所述方法包括：a)提供多个核酸构建体，每个构建体包括：可操作地连接于表达控制序列的编码细小病毒的衣壳蛋白的核苷酸序列和在所述可操作地连接于表达控制序列的编码细小病毒衣壳蛋白的核苷酸序列的侧翼的至少一个细小病毒的反向末端重复(ITR)序列；b)将所述多个核酸构建体转移到能表达细小病毒的Rep蛋白的昆虫细胞中；c)将所述昆虫细胞置于允许表达细小病毒的衣壳蛋白和细小病毒的rep蛋白的条件下，使得所述核酸构建体可以被包装在细小病毒的衣壳中以提供细小病毒的病毒体；d)从所述昆虫细胞和/或昆虫细胞上清本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.包括表达控制序列的核酸构建体，所述表达控制序列用于在昆虫细胞中表达包括开放阅读框的核苷酸序列，其中所述开放阅读框序列编码：/ni)腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白VP1、VP2和VP3；和/nii)用于VP1的ATG翻译起始密码子；/n所述核苷酸序列包括在所述开放阅读框上游的选择性起始密码子，所述选择性起始密码子在所述开放阅读框的框外。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170720 EP 17182429.51.包括表达控制序列的核酸构建体，所述表达控制序列用于在昆虫细胞中表达包括开放阅读框的核苷酸序列，其中所述开放阅读框序列编码：
i)腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白VP1、VP2和VP3；和
ii)用于VP1的ATG翻译起始密码子；
所述核苷酸序列包括在所述开放阅读框上游的选择性起始密码子，所述选择性起始密码子在所述开放阅读框的框外。


2.根据权利要求1的核酸构建体，其中所述选择性起始密码子选自由以下组成的组：CTG、ATG、ACG、TTG、GTG、CTC和CTT。


3.根据权利要求1或权利要求2的核酸构建体，其中所述核苷酸序列包括以所述选择性起始密码子起始的选择性开放阅读框，其涵盖所述用于VP1的ATG翻译起始密码子。


4.根据权利要求3的核酸构建体，其中所述选择性起始密码子后的所述选择性开放阅读框编码最多20个氨基酸的肽。


5.根据权利要求1至4任一项的核酸构建体，其中邻近所述开放阅读框并包括所述选择性起始密码子的核苷酸序列为SEQIDNO.1的核苷酸残基1-8。


6.根据权利要求5的核酸构建体，其中包括用于VP1的ATG翻译起始密码子的所述开放阅读框具有SEQIDNO:1的核苷酸序列，其中第9-11位的残基代表所述用于VP1的ATG翻译起始密码子。


7.根据权利要求1至6任一项的核酸构建体，其中所述开放阅读框的所述第二密码子编码选自由丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、天冬氨酸和谷氨酸组成的组的氨基酸残基。


8.根据权利要求1至7任一项的核酸构建体，其中所述AAV衣壳蛋白是AAV血清型衣壳蛋白。


9.根据权利要求1至8任一项的核酸构建体，其中所述核酸构建体包括选自由以下组成的组的启动子：多面体启动子、p10启动子、4xHsp27EcRE+最小Hsp70启动子、deltaE1启动子和E1启动子。


10.根据权利要求1至9任一项的核酸构建体，其中所述核酸构建体是杆状病毒载体。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·J·F·杜普莱西斯，O·特布雷克，S·M·博斯马，H·P·A·彼得里，J·卢贝尔斯基，
申请(专利权)人：优尼科IP有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL