基孔肯雅病毒病毒样颗粒的制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及基孔肯雅病毒病毒样颗粒的制备方法，其是通过融合PCR技术分别对的基孔肯雅病毒(CHIKV)结构蛋白编码基因C-E3-E2-6K-E1基因元件进行改造，然后将的上述基因改造元件克隆入昆虫细胞表达载体中，再将该重组表达载体分别转染SF9昆虫细胞，并使其分泌表达CHIKV病毒样颗粒(VLPs)。另外，本发明专利技术对CHIKV?VLPs的免疫效果及对病毒特异性抗体检测进行了初步研究，为基于CHIKV?VLPs的免疫学检测试剂乃至疫苗的研制奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及病毒学、分子生物
，具体地说涉及基孔肯雅病毒病毒病毒样颗粒的制备方法和应用。
技术介绍
基孔肯雅病毒(Chikungunya virus,CHIKV)病毒经伊蚊叮咬传播，引起以发热、关节疼痛等为主要特征的自限性传染性疾病基孔肯雅热(Chikungunya fever, CHIK)。1952 年在坦桑尼亚发生暴发流行中首次分离CHIKV，亚洲地区于1958年在泰国首次分离CHIKV。 随后在非洲、亚洲包括印度次大陆发生了多次CHIK的暴发流行，累计报告病例超过800万。 据世界卫生组织报告，全球有37个国家和地区呈地方性流行或具有潜在地方性流行风险。CHIKV属于披膜病毒科甲病毒属的单股正链RNA病毒，基因组约含有11-1 核苷酸，基因排列顺序为5, -NCR-NS1-NS2-NS3-NS4-C-E3-E2-6K-E1-3'，共编码5个结构蛋白和4个非结构蛋白。病毒颗粒为球形，直径约为60-70nm。病毒糖蛋白El和E2镶嵌在由脂质双层膜构成的病毒包膜上，介导病毒吸附宿主细胞并与细胞膜融合，病毒进入靶细胞是通过依赖Epsl5的内吞作用实现的。根据抗原特性分类，该病毒属于kmliki森林病毒 (SFV)群与ο' nyong-nyong病毒基因组同源性高，存在血清学交叉反应。目前流行的CHIKV 分为3个基因型，即西非型、亚洲型和东中南非洲型(ECSA)，每一基因型的病毒一般在相应的地理区域呈地方性流行，直到2005-2006年ECSA型病毒传入亚洲，引发了印度洋群岛、印度及东南亚地区CHIK大暴发。生物信息学分析显示CHIKV是由存在于非洲大陆的共同祖先进化而来，大约70-90年前传到亚洲。CHIKV的致病机理知之甚少，病毒能够感染包括表皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞和巨噬细胞等，病毒复制可诱发细胞病变和凋亡，诱导细胞凋亡也可能是病毒规避宿主免疫系统的机制。对临床发病数周后患者肌肉组织活检发现肌卫星细胞中存在病毒抗原，显示CHIKV可能长期存在于感染者体内。病毒感染方式影响宿主的免疫应答，经蚊叮咬感染与经注射感染病毒诱发的免疫反应显著不同。在急性期，血清中病毒载量决定促炎症细胞因子的特异性表达模式，细胞和组织破坏相关的临床症状可能和细胞因子的异常表达及细胞凋亡有关，与疾病的严重程度相关。在慢性期，IL-6和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子水平和持续性关节病相关，同时CD8+T淋巴细胞缺失或失活导致细胞免疫缺陷可能是造成疾病迁延不愈的机制之一。抗体介导的免疫增强机制也可能存在于CHIKV感染过程。人感染CHIKV后可获得终身免疫，诱导机体产生中和抗体，抑制病毒胞外传播。基于病毒膜蛋白的病毒样颗粒和DNA疫苗能够诱导非人灵长类有效的体液和细胞免疫，诱导产生的抗血清能够保护免疫缺陷动物免受病毒感染。CHIKV的自然宿主为人和灵长类动物，主要传播媒介为埃及伊蚊、白纹伊蚊、非洲伊蚊和带叉-泰氏伊蚊，不同蚊种在传播中的重要性不同，埃及伊蚊为家栖蚊种，传播基孔肯雅病毒能力最强。在非洲，丛林型疫源地在病毒循环中起重要作用，受感染的灵长类和其他野生动物是主要传染源，病毒主要以灵长类-蚊-灵长类的方式循环，病毒流行可长期循环存在，主要流行于雨季，旱季时减轻。在亚洲CHIKV主要以城市型模式流行，病人和隐性感染者为主要传染源，病毒主要以人-蚊-人的方式循环，流行以不定期的暴发为主。人群普遍易感，在易感人群中病毒感染率可高达40-85%，隐性感染患者所占感染者的比例还不清楚，2006年印度报告130多万CHIK病例，但无症状感染的比例很低，并首次出现死亡病例。虽然直接由CHIKV引起死亡的病例很少，但是在CHIK流行期人群月报告死亡率明显高于非流行期，提示基孔肯亚热可能增加其他疾病的病死率。CHIK流行造成当地严重的公共卫生负担，在印度洋地区发生的大暴发中患者平均误工时间为35天，多于60% 患者发病急性期过后有约18个月的持续性关节痛。除了经输血传播外，没有人传人的报道，孕妇围产期后期感染病毒可发生母婴传播引起新生儿感染，但没有经母乳传播病毒的证据。在蚊中病毒可通过交配由雄蚊传播给雌蚊，也可以经卵传播给幼蚊。在登革热和基孔肯亚热共同流行地区常有人同时感染CHIKV和登革病毒。感染CHIKV后，从出现临床症状开始，病毒血症期大约为7天，病毒血症期的感染者进入具有传播媒介地区可导致地方性流行甚至大暴发。最典型的例子是2004 年肯尼亚CHIK暴发，病毒输入亚州，适应了当地蚊媒并传播，引发了大暴发，迄今报告病例超过300万。意大利、法国等非流行地区出现本土传播，造成暴发。控制措施严格的新加坡也由于输入性病例曾数次引起本土大规模暴发，但由于及时明确传播媒介，采取妥善措施， 使疫情迅速得到控制。在我国，曾经在云南、海南等地患者、媒介生物和蝙蝠中分离到疑似 CHIKV病毒，并在人以及部分哺乳动物血清中检测到抗体，首个明确的输入性病例是2008 年由斯里兰卡传入的，属印度洋流行株，没有引起本地传播，但是2010年在广东省东莞地区发生了较大规模的暴发，报告200多病例。和其他RNA病毒相似，CHIKV可以通过基因的多样性和改变宿主来实现适应性进化。城市型流行的病毒基因组核苷酸替代突变的发生率明显高于丛林型动物间流行的病毒，可能两种疫源地病毒传播模式和进化机制不完全相同。2005年ECSA型CHIKV传入亚洲，病毒包膜蛋白El发生A226V替代突变，白蚊伊蚊取代埃及伊蚊成为主要媒介，引发了大暴发。E1-A226V没有改变病毒的毒力，但是增加了 CHIKV对白蚊伊蚊的感染性，提高了病毒在白蚊伊蚊中扩增和传播的能力，缩短了病毒在媒介中的外潜伏期，外潜伏期的缩短使感染了病毒的伊蚊更快的具有传染性。埃及伊蚊对CHIKV高度易感，吸食带毒血液2天后蚊虫唾液即具有感染性，但是对于E1-226V突变株，白蚊伊蚊的传播效率略高于埃及伊蚊。 另外，CHIKV E2蛋白G60D的替换突变也是影响两种蚊媒病毒感染性的重要因素，但是对于 E1-A226V突变株对白蚊伊蚊的感染性影响轻微，E2-I211T突变则显著影响E1-A226V突变株对白蚊伊蚊感染性，相反对埃及伊蚊没有明显的影响。因此，进行病毒的分子遗传学特性以及蚊媒种类监测对于加强疫情预测和控制具有重要的意义。随着全球化进展，物流人流的交换更加快捷频繁，非本土动、植物引入日益增多， 一些媒介昆虫分布的地理界限被打破，能够在很短的时间内进行长距离迁移，如果能够适应当地的环境，就会形成一个新的分布区域。在过去50年，伊蚊在全球的分布范围不断扩大，白蚊伊蚊已经扩散到全球所有的大陆并适应了大部分地区的环境。在我国，埃及伊蚊主要分布于台湾南部、海南以及福建、广东和广西的部份沿海地区，云南边境地区也发现该蚊存在。白纹伊蚊的分布范围广泛，北至辽宁，西北至陕西，西南至西藏，北纬34°以南更常见。一些虫媒病毒存在对不同地域蚊虫的易感性不同的现象，在传播虫媒病毒的效率上也存在差异，某特异蚊媒群落可能具有较高的媒介能力。其他国家多起病原输入，适应媒介， 引起暴发的先例，为我国虫媒传染病防治敲响了警钟。国内存在多种多样的媒介传播体系， 如果新的病原引入，就有疫情暴发流行的可能，传染病疫情报告不完整不及时更增本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．编码基孔肯雅病毒病毒样颗粒的基因，其特征在于，其具有Ｓｅｑ　ＩＤ　Ｎｏ．１所示的核苷酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个核苷酸形成的具有编码同等功能蛋白质的核苷酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李德新，李建东，梁米芳，胡孔新，张全福，王世文，李川，张硕，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，
类型：发明
国别省市：11