本发明专利技术属于分子生物学领域，公开了一种新的猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5修饰基因及其应用。猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5修饰基因，序列如SEQ?IDNO.2、SEQ?IDNO.3、SEQ?IDNO.4或SEQ?IDNO.5所示。含有该猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5修饰基因的重组质粒。含有所述的重组质粒的减毒沙门氏菌SL-pCI-SynGP5/GP4-5。结果显示所构建的重组质粒能够诱导产生较高水平的体液免疫应答、淋巴细胞增殖应答以及细胞因子应答。重组沙门氏菌能够诱导较高水平的抗体应答；诱导较高水平的干扰素；病毒血症水平低；攻毒后组织器官的损伤比较轻微，生物安全水平高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，涉及一种新的猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5修饰基因及其应用。
技术介绍
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白(又称E蛋白)是由0RF5编码的囊膜蛋白，是病毒的一个主要结构蛋白。E蛋白是一种跨膜糖蛋白，位于病毒粒子的包膜上，是重要的保护性抗原蛋白，但不能产生较强的中和抗体，GP5基因免疫保护效率也不理想，其可能的主要原因是(1)GP5蛋白中存在中和表位和非中和表位，非中和表位对中和表位有干扰作用；0)GP5蛋白上的糖基化位点也能使病毒发生免疫逃避，从而使产生的抗体水平降低；C3)基因在猪体细胞内表达效率比较低，抗原递呈作用比较弱，因此，为了提高基因疫苗免疫效力，有必要对这3个方面进行综合考虑，设计出新的抗原分子。鼠寒沙门氏菌属于肠杆菌科，是一组胞内侵袭性致病菌，故能有效递呈抗原，激发抗沙门氏菌和诱导外源蛋白的特异性体液免疫反应与细胞免疫反应，并能同时诱导黏膜免疫与全身免疫。近年来减毒沙门氏菌作为DNA疫苗载体的研究越来越多，通过黏膜自然感染途径运送DNA疫苗，是一种很有前途的方法，有报道用该菌携带PRRSV GP5-M基因可以诱导小鼠产生PRRSV特异性免疫。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供新的猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5修饰基因。本专利技术的另一目的是提供含有该修饰基因的重组质粒。本专利技术的又一目的是提供携带该重组质粒的减毒鼠寒沙门氏菌SL-pCI-SynGP5/ GP4-5。本专利技术的目的通过如下技术方案实现猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5修饰基因，序列如SEQ IDN0. 2、SEQ IDN0. 3、SEQ IDN0. 4 或 SEQ IDN0. 5 所示。含有所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5修饰基因的重组质粒。所述的重组质粒优选将所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5修饰基因插入真核表达载体PCI的)(ho I和)(ba I酶切位点间。所述的重组质粒进一步优选将SEQ IDN0. 3所示的猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5 修饰基因插入真核表达载体pCI的Bio I和)(ba I酶切位点间。含有所述的重组质粒的减毒沙门氏菌SL-pCI-SynGP5/GP4-5。本专利技术所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5修饰基因在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗中的应用。本专利技术所述的含有猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5修饰基因的重组质粒在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗中的应用。本专利技术所述的减毒沙门氏菌SL-pCI-SynGP5/GP4-5在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗中的应用。本专利技术的有益效果本专利技术针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白在猪体细胞内表达效率比较低，抗原递呈作用比较弱，不能产生较强的中和抗体，免疫保护效率不理想的缺陷，通过对高致病性PRRSV SY0608毒株0RF5基因进行了 3个方面的修饰和改造，设计出新的抗原分子编码基因，主要包括(1)根据哺乳动物偏嗜性，对天然的GP5基因密码子进行优化，改成哺乳动物偏嗜的密码子；( 突变糖基化位点，将第30、34、35和51位的氨基酸N(天冬氨酸)改变成A(丙氨酸)；(3)利用最新发现的PRRSV GP4和N蛋白上的T细胞表位，分别插入至GP5蛋白非中和抗原表位和中和表位中间，并构建含有该修饰基因的重组质粒，发现其在哺乳动物细胞中表达效率显著高于原始基因。所构建的重组质粒能够诱导产生较高水平的体液免疫应答、淋巴细胞增殖应答以及Thl和Th2型细胞因子应答。将筛选得到的体液免疫应答、淋巴细胞增殖应答以及Thl和Th2型细胞因子应答水平最高的修饰基因重组质粒pCI-SynGP5/GP4-5转化至减毒鼠寒沙门氏菌，获得重组沙门氏菌SL-pCI-SynGP5/GP4-5，分别进行小鼠免疫试验和仔猪攻毒保护免疫试验，发现其较之重组质粒pCI-SynGP5/GP4-5能够诱导较高水平的抗体应答；诱导较高水平的干扰素；病毒血症水平低；攻毒后组织器官的损伤比较轻微，生物安全水平高。以上结果证明本专利技术所构建的减毒沙门氏菌SL-pCI-SynGP5/GP4-5在猪体实验中有良好的免疫效果，在蓝耳病的防制方面有开发和应用前景，可在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗中应用。附图说明图1GP5基因的扩增，1 为 Marker，2 为 GP5 基因。图 2 酶切得到的基因 SynGP5、SynGP5/GP4_5 和 SynGP5/N_7，IMarker, 2、3、4 分别为 SynGP5、SynGP5/GP4_5 和 SynGP5/N_7。图 3SynGP5/GP4_3 基因的扩增，a、基因 SynGP5-GP4_3 的扩增；b、基因 GP4_3_SynGP5 的扩增；C、基因 SynGP5/ GP4-3 的扩增；其中，1、3、5 为 Marker，2、4、6 分别为 SynGP5-GP4-3、GP4-3_SynGP5、SynGP5/ GP4-3。图4重组真核质粒的双酶切鉴定，其中，1:lkb DNALadder ；2 =DNALadder DL2000 ；3 :Xho I 和 Xba I 双酶切的 pCI-neo载体；4 =Xho I和Xba I双酶切的pCI_GP5重组质粒；5 =Xho I和Xba I双酶切的 pCI-SynGP5重组质粒；6 :Xho I和Xba I双酶切的pCI_SynGP5/GP4_5重组质粒；7 :Xho I和 Xba I 双酶切的 pCI-SynGP5/N-7 重组质粒；8 :Xho I 和 Xba I 双酶切的 pCI_SynGP5/GP4_3重组质粒。图5Western blot鉴定蛋白的表达，其中，1 :pCI-neo载体转染HEK193A的细胞裂解产物；2 :pCI_GP5重组质粒转染HEK193A的细胞裂解产物；3 :PCI-SynGP5重组质粒转染HEK193A的细胞裂解产物；4 pCI-SynGP5/GP4-5重组质粒转染HEK493A的细胞裂解产物；5 :pCI-SynGP5/N_7重组质粒转染HEK193A的细胞裂解产物；6 :PCI-SynGP5/GP4-3重组质粒转染HEK193A的细胞裂解产物。图6重组真核质粒诱导抗体应答；其中，a =ELISA抗体应答；b 中和抗体应答。图7重组真核质粒免疫鼠诱导的淋巴细胞增殖应答。图8重组真核质粒免疫鼠脾细胞体外诱导的细胞因子应答，其中，a:IFN_ γ ;b :IL_4。图9重组沙门氏菌质粒的双酶切鉴定，其中，1=DNALadder DL2000 ；2 :Xho I 和 Xba I 双酶切的 pCI-SynGP5/GP4_5。图10免疫猪外周血淋巴细胞体外诱导的细胞因子检测。图11攻毒后各免疫组及对照组的平均体温变化。图12攻毒后各组的病毒血症检测。图13攻毒后各组的肺脏组织病理学观察。具体实施例方式实施例1猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5基因修饰及其真核表达质粒的构建与鉴定1. 1引物设计根据PRRSV SY0608毒株GP5基因序列(GenBank: :EU144079. 1)设计合成一对特异性引物SY GP5. 1和SY GP5. 2，以pShuttle_GP5质粒(李玉峰，姜平，等.猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白重组腺病毒的构建与免疫原本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．猪繁殖与呼吸综合征病毒ＯＲＦ５修饰基因，其特征在于序列如ＳＥＱ ＩＤＮＯ．２、ＳＥＱ ＩＤＮＯ．３、ＳＥＱ ＩＤＮＯ．４或ＳＥＱ ＩＤＮＯ．５所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：姜平，华莉，李玉峰，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：84
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。