包含灭活的基孔肯亚病毒株的疫苗组合物制造技术

公开了用于预防和治疗基孔肯亚病毒感染的疫苗组合物，其能够针对基孔肯亚病毒的任何基因型变异体给予免疫力。更特别地，本发明专利技术公开了特定的核苷酸序列和其翻译的蛋白质，所述蛋白质可被表达为用作抗基孔肯亚病毒感染的疫苗抗原的病毒样粒子。本发明专利技术中公开的组合物对可被该疾病的任何适合载体包括白纹伊蚊和埃及伊蚊所传播的基孔肯亚病毒的任何基因型变异体也具有保护作用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术涉及用于对基孔肯亚（Chikungunya）病毒引起的任何感染的预防和治疗的稳定的免疫原性组合物。本专利技术特别涉及基孔肯亚病毒（此后称为CHIKV）株的组合物和其病毒的亚单位抗原用于人类中基孔肯亚感染的预防、治疗处理和诊断的用途。尤其是，本专利技术涉及用于基孔肯亚病毒的任何基因型或抗原性变异体或突变体的预防和治疗的稳定的免疫原性疫苗组合物，所述免疫原性疫苗组合物给予对基孔肯亚病毒的任何基因型变异体或突变体的血清保护足够的抗体滴度。本专利技术也涉及用于对基孔肯亚病毒联合选自以下列表的其它细菌性和病毒性感染的免疫的疫苗组合物，该列表包括但不限于日本脑炎病毒疫苗、登革热疫苗、西尼罗河病毒疫苗和金迪普拉（Chandipura）病毒疫苗和狂犬病疫苗。与其它病毒疫苗的组合也在本专利技术的范围之内。专利技术背景基孔肯亚病毒（CHIKV）是科披膜病毒科（Togaviridae）的甲病毒。它是引起特征为高热和多发性关节痛突然发病的通常非致死性感染的正链RNA病毒。自从2005年的复活感染以来，报告了迄今未与CHIKV感染关联的包括癫痫（seizure）、淋巴结病、暴发性肝炎和结膜炎的出血性和神经系统表现（Sourisseau等人，2007；Kannan等人，2007）。基于部分E1结构糖蛋白序列的系统发育分析已经确认了三个CHIKV谱系，西非、亚洲以及东部、中部和南部非洲（ECSA）（Power等人，2000）。亚洲谱系在印度和东南亚传播，直至它被ECSA基因型代替，后者在印度洋岛的2005-2006年爆发期间出现（Yergolkar等人，2006）。本地建立的ECSA株的亚谱系被旅行者从地方性区域传播至非洲、亚洲和欧洲并引起当地爆发（Powers和Logue，2007）。在2006年，将近一百三十九万基孔肯亚病毒感染疑似病例发生于印度。（印度国家载体传播疾病控制项目（National Vector Borne Disease Control Programme，NVBDCP），2007）这由携带E1-226A的ECSA株引起（Arankalle等人，2007）。增加通过白纹伊蚊（Aedes albopictus）的传播性的E1-A226V适应性突变对自从那时病毒的广泛地理传播负责（de Lamballerie等人，2008）。在自从2005年以来基孔肯亚病毒的爆炸性爆发中牵涉到宿主免疫压力和导致的在CHIKV基因组的人白细胞抗原（HLA）1类限制性元件中的位点特异性突变（Tong等人，2010）。本领域已知的现有技术不包括任何来源于ECSA株的疫苗候选者。Bharat Biotech International Limited早些时候开发了（公开于WO2008/026225）带有E1-226A的2006ECSA株和它在抗基孔肯亚病毒感染的潜在疫苗的开发上的用途。城市（流行性）传播周期的基孔肯亚病毒株显示了比地方流行性（森林型（sylvatic））周期的病毒株更高的进化率，两种传播周期的进化动力学上的区别受决定病毒-宿主相互作用的几个因素影响，例如载体多样性和丰度、载体幼虫栖息地和人群中的群体免疫力（herd immunity in the population）（Volk等人，2010）。虫媒病毒如基孔肯亚与节肢动物和脊椎动物宿主都相互作用，且对于包膜糖蛋白的选择压力受对载体适应的偏爱和脊椎动物宿主免疫防卫机制驱动。病毒进化趋向于选择参与中和的抗原决定簇以及参与载体/宿主适应的那些残基的突变。开发中的疫苗例如WO2008030220和Akahata等人2010中公开的疫苗利用西非基因型和E1-A226V分离株。另一个CHIKV疫苗开发是与本专利技术中公开的疫苗范围不同的DNA疫苗（Mallilankaraman等人，2011）。为减毒活疫苗的较早的原型疫苗使用病毒的亚洲基因型（Edelman等人，2001）。目前DNA疫苗在人类预防性疫苗接种中还不成功，CHIKV减毒活疫苗在接受疫苗的人类受试者中引起副作用（Edelman等人，2001）。用于早期疫苗开发中的CHIKV株（WO2008/026225）为带有E1-226A的2006ECSA株。如本专利技术所公开的在2009-2010年从印度分离的株属于ECSA谱系内的不同的亚谱系并携带在E2和E1包膜糖蛋白处的新突变。研究中报告的所有分离株中的E1糖蛋白中的突变之一定位在决定宿主载体特异性并在对埃及伊蚊（Aedes aegypti）的增强适应的显著正选择之下的区域，埃及伊蚊是区域中且事实上在基孔肯亚病毒感染的流行现在是地方性的热带国家中最丰富的蚊载体。也公开了迄今未报告的其它新突变。因此期望制备将对基孔肯亚病毒的ECSA株的新开发的和不同的亚谱系给予免疫力、也将对载体埃及伊蚊传播的ECSA株的其它突变株给予免疫保护的疫苗组合物。本申请中的专利技术人在长期的研究后在本申请中公开了包括与较早的疫苗（WO2008/026225）相比具有其它额外优势的这样的有效疫苗，其它额外优势例如灭活病毒的新方法和使用增强灭活病毒疫苗的免疫原性的新佐剂的改进制剂和重组亚单位疫苗和在此也包括在本专利技术中的病毒体（virosome）。专利技术目标本专利技术的一个目标是提供能够预防以及提供治疗基孔肯亚病毒引起的感染的稳定疫苗组合物。所述疫苗组合物适用于基孔肯亚病毒的任何基因型变异体的预防和其治疗。本专利技术的另一个目标是提供能够预防以及提供治疗由任何适当的载体传播的基孔肯亚病毒引起的感染的稳定疫苗组合物，其包括预防和治疗由刚好是基孔肯亚病毒最常见的适应性载体的载体白纹伊蚊和埃及伊蚊传播的基孔肯亚感染。本专利技术的又另一个目标是提供对基孔肯亚病毒特别是ECSA株和其适用的特别不同和独特的亚谱系的任何基因型变异体有效的稳定的疫苗组合物。本专利技术的又一个目标是提供其中疫苗的抗原成分包括整个灭活病毒粒子或者能被表达为病毒样粒子（此后称为VLP）的重组CHIKV病毒株的亚单位抗原联合适当的药学可接受载体、稳定剂和佐剂的稳定的疫苗组合物。本专利技术的又另一个目标是提供制备能够引起足以预防以及提供治疗由基孔肯亚病毒的任何基因型突变体或变异体引起的感染的免疫应答的稳定的疫苗组合物的方法，所述方法包括CHIKV病毒灭活和以适当的量与佐剂混合。本专利技术的另一个目标是提供对于人类中基孔肯亚病毒感染的诊断有用的针对基孔肯亚病毒株或其亚单位抗原如此产生的抗体。本专利技术的又一本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种灭活基孔肯亚病毒株或来源于所述病毒株的纯化病毒抗原的稳定疫苗组合物，所述病毒株具有加强所述病毒对埃及伊蚊（Aedes aegypti）的适应性的一个或多个突变，并能够感染白纹伊蚊（Aedes albopictus），所述灭活基孔肯亚病毒株或来源于所述病毒株的纯化病毒抗原作为对基孔肯亚病毒引起的感染的预防、治疗和诊断的治疗活性成分，因此使得它能够针对基孔肯亚病毒的任何基因型变异体或突变体给予免疫力。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.06.17 IN 2067/CHE/20111.一种灭活基孔肯亚病毒株或来源于所述病毒株的纯化病毒抗原的
稳定疫苗组合物，所述病毒株具有加强所述病毒对埃及伊蚊（Aedes 
aegypti）的适应性的一个或多个突变，并能够感染白纹伊蚊（Aedes 
albopictus），所述灭活基孔肯亚病毒株或来源于所述病毒株的纯化病毒抗
原作为对基孔肯亚病毒引起的感染的预防、治疗和诊断的治疗活性成分，
因此使得它能够针对基孔肯亚病毒的任何基因型变异体或突变体给予免
疫力。
2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中基孔肯亚病毒分离株的
所述株选自含有用于结构抗原在真核或原核表达载体中的重组克隆和表
达以用作针对基孔肯亚病毒感染的潜在疫苗候选者的在SEQ ID NO.1到
SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.15到SEQ ID NO.20中公开的核苷酸序列的
TN01610、TN015110、TN06210、TN06310、TN06410和AP109。
3.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述基孔肯亚病毒株具
有单个的或者与选自所述基孔肯亚病毒的结构多蛋白序列的A232V、
D301N、K327N、G380R、K391E、V589A、P867L,、G1004R和A1035V
的其它突变相组合的对应于E1结构糖蛋白中的E1-K211E的所述结构多蛋
白中的非同义突变K1020E。
4.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述基孔肯亚病毒分离
株具有分别对应于核苷酸SEQ ID NO.1到SEQ ID NO.7的在SEQ ID NO.8
到SEQ ID NO.14中公开的结构多蛋白序列，用作抗基孔肯亚病毒感染和
其任何基因型或突变体的疫苗抗原。
5.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述治疗活性抗原是如
公开的所述基孔肯亚病毒株的衣壳蛋白和结构糖蛋白的组合，包含用于表
达为病毒样粒子的C-E3-E2-6K-E1、C-E2-E1和E2-E1蛋白。
6.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中用于表达如公开的所述
基孔肯亚病毒株的重组蛋白的所述原核表达系统是大肠杆菌（E.coli），且

\t所述真核表达系统是酵母巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）。
7.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述基孔肯亚病毒通过
任何以下方法灭活：
i)45℃到60℃下热灭活30分钟到4小时；
ii）在254nm下紫外线照射30分钟到120分钟；...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·M·埃拉，苏玛斯·坎达斯瓦弥，
申请(专利权)人：伯哈拉特生物技术国际有限公司，
类型：发明
国别省市：印度;IN