一种疫苗组合物及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种用于预防和治疗猪细小病毒的亚单位疫苗组合物及其制备方法。本发明专利技术选用猪细小病毒HN-2011株的VP2基因，构建重组了能够稳定表达PPV VP2蛋白的杆状病毒。制备方法如下：培养能够稳定表达PPV VP2蛋白的杆状病毒，收获有效蛋白，辅以佐剂制备成疫苗。本发明专利技术制备获得的猪细小病毒亚单位疫苗使用方便，更为安全，而且免疫效果优于传统的全病毒灭活疫苗，抗体水平显著提高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因生化领域，具体涉及猪细小病毒亚单位疫苗组合物及其制备方法。
技术介绍
猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)能够引起母猪繁殖障碍疾病，导致母猪产死胎、木乃伊胎、早期胚胎死亡和母猪不育等病症。此外PPV还与猪非化脓性心肌炎、皮炎、肠炎及病毒血症等有关。PPV在世界各地广泛存在，给养猪业造成巨大的经济损失。猪细小病毒属于细小病毒科细小病毒属成员，病毒外观呈六角形或圆形，二十面体等轴立体对称，无囊膜，直径为20-23nm，衣壳蛋白由32个壳粒组成，核心含有单股负链DNA。猪细小病毒的主要免疫原性抗原是PPV结构蛋白。PPV基因组编码了 3种结构蛋白:VPU VP2、和VP3，它们的分子量分别为为84kDa、64kDa和60kDa。Martinez等(1992)将PPV VP2基因成功的克隆到杆状病毒表达系统中，利用VP2蛋白自我组装的特性，在体外成功的表达了 PPV类病毒粒子(Virus-Like Paritcles VLPs)，用其免疫母猪能诱导产生免疫应答。其免疫效果与商品化的PPV疫苗的相同。杆状病毒载体系统(baculovirusexpression vector system,BEVS)是以昆虫杆状病毒为外源基因载体，以昆虫和昆虫细胞为受体的表达系统。使用一个或多个启动子，将外源目的基因插入到启动子下游，获得重组病毒，这种重组病毒在昆虫细胞或虫体内复制的同时，使外源基因得到表达。本实验中选用该系统对PPV VP2蛋白进行表，并结合不同的佐剂，形成PPV亚单位疫苗。我国每年因猪细小病毒病的爆发给我国养猪业带来了巨大的经济损失，研制出具有良好免疫效果的亚单位疫苗对于猪细小病毒病的防制具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的旨在提供一种含有PPV VP2的重组蛋白的PPV亚单位疫苗，通过动物实验证明该亚单位疫苗对于猪针对PPV具有良好的免疫作用。本专利技术提供一种疫苗组合物，其包括含有PPV VP2蛋白基因序列的猪细小病毒亚单位抗原。优选地，所述猪细小病毒亚单位抗原为编码含有SEQ.N0.2的氨基酸序列。优选地，所述PPV VP2蛋白基因序列来自编码含有SEQ.N0.1的基因序列。优选地，所述亚单位抗原的血凝价为29~216。所述的疫苗组合物，还包括疫苗佐剂，所述疫苗佐剂为ISA206、氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆、GelOl、蜂胶、脂质体、ISA760VG中的一种或几种的组合物。本专利技术还提供一种制备所述PPV VP2蛋白的方法，包括如下步骤:I)进行PPV VP2蛋白基因的TA克隆，获得包含PPV VP2基因的转移载体；2)回收目的片段，并与PMD-18T载体连接，并转化E.coli DH5 α感受态细胞中，碱裂解法提取质粒，获得的阳性克隆命名为PT-VP2 ；3)构建重组质粒pFastBac_VP2载体，所得重组阳性质粒命名为pFastBac_VP2 ；4)将pFastBac_VP2转化至DHlObac感受态细胞，筛选出阳性重组菌落，提取重组Bacmid-VP2，将提取的Bacmid_VP2转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒；5)由重组杆状病毒-昆虫细胞表达PPV VP2蛋白，收获、鉴定及纯所述PPV VP2蛋白。优选地，所述步骤I)中PPV VP2基因序列为编码含有SEQ.N0.2的氨基酸序列。本专利技术提供一种制备所述疫苗组合物的方法，其特征在于，包括以下步骤:(1)进行PPV VP2蛋白基因的TA克隆；(2)构建重组能够稳定表达PPV VP2蛋白的杆状病毒；(3)将PPV VP2蛋白抗原与疫苗佐剂按比例混合，制备成疫苗组合物。本专利技术提供所述的疫苗组合物在制备用于母猪的免疫的产品中的应用。一细小病毒亚单位蛋白的制备方法，其特征在于:I) VP2目的基因的TA克隆；2) PCR胶回收目的片段，并与PMD-18T载体连接，并转化E.coli DH5 α感受态细胞中，碱裂解法提取质粒，用BamH I和Sal I做双酶切鉴定，获得的阳性克隆命名为PT-VP2，并送至宝生物(大连)生物技术有限公司测序；3 )按照AcNPV Bac-to-Bac杆状病毒表达系统操作说明书步骤重组质粒pFastBac-VP2载体的构建与鉴定用BamH I和Sal I双酶切PT-VP2，将VP2基因克隆至pFastBacl载体，用BamH I和Sal I双酶切载体鉴定，并送至测序公司鉴定，所得重组阳性质粒命名为pFastBac-VP2 ；4)重组杆状病毒的获得将pFastBac_VP2转化至DHlObac感受态细胞，筛选出阳性重组菌落，提取重组Bacmid-VP2，重新合成I对引物PCR鉴定。将提取的Bacmid_VP2转染昆虫细胞，2至3d收取上清即为重组的杆状病毒；5)重组蛋白的收获、鉴定及纯化病毒感染昆虫细胞，3至4d后，下层细胞做IFA鉴定目的蛋白的表达；SDS_PAGE胶、Western-blotting与血凝实验鉴定目的蛋白的表达。本专利技术可以获得的有益效果至少包括:I)目的蛋白表达的高效性:采用本基因序列表达目的蛋白在杆状病毒-昆虫细胞中获得有效表达出的蛋白血凝价闻。2)制备方便:重组杆状病毒感染的昆虫细胞能够表达PPV VP2蛋白，只需灭活昆虫病毒、裂解昆虫细胞，硫酸铵沉淀等简单处理程序即可以直接应用于畜禽疾病的临床应用，所制备的蛋白，血凝价高。3)疫苗免疫保护效果较好:通过动物试验检测该亚单位疫苗效果，抗体水平较传统的灭活疫苗高。初次免疫就能产生较高的抗体水平；表达蛋白血凝性较高。【附图说明】图1:PCR扩增VP2基因。图2:酶切鉴定PT-VP2。图3:酶切鉴定 pFastBac-VP2。图4:重组杆状病毒PCR鉴定。图5:目的蛋白IFA鉴定。图6:目的蛋白 SDS-PAGE。图7:动物实验结果。【具体实施方式】以下配合本专利技术的优选实施例，进一步阐述本专利技术为达成预定专利技术目的所采取的技术手段。实施例1PPV VP2某闵的TA克降1.1VP2目的基因的TA克隆VP2基因来自以猪细小病毒为HN-2011株，已在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏日期:2010年6月7日，保藏号为CCTCCN0.V201118。根据NCBI中GenBank中NADL-2 (NC: 001718)的核苷酸序列，利用primer5.0设计I对引物Pl与P2，并加入合适的酶切位点，引物序列如下:5-TGA GGA TCC ATG AGT GAA AAT GTG GAA C_3 (BamH I )5-CGC GTCGAC TTC TAG TAT AAT TTT CTT G_3 (Sal I )PCR 扩增体系为在 50 μ L 体系中进行:包括 5XPS BufferlO μ L、dNTP4 μ L、FD, RV(IOpmoI / μ L) I μ L>PrimerSTAR HS DNA Polymerase0.3 μ L、DNA 模板 I μ L、加灭菌水补足M 50 μ L0PCR反应条件分别为:预变性95。C5min，变性 94。C30s，退火 55。C30min，延伸 72。C3min ;扩增循环数为30次；最后，于72° C总延伸7min。以I X TAE缓冲液配制1%琼脂糖凝胶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种疫苗组合物，其特征在于，包括含有PPV VP2蛋白基因序列的猪细小病毒亚单位抗原。

【技术特征摘要】
1.一种疫苗组合物，其特征在于，包括含有PPV VP2蛋白基因序列的猪细小病毒亚单位抗原。2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述猪细小病毒亚单位抗原为编码含有SEQ.N0.2的氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述PPVVP2蛋白基因序列来自编码含有SEQ.N0.1的基因序列。4.根据权利要求广3中任一项所述的疫苗组合物，其特征在于，所述亚单位抗原的血凝价为29~216。5.根据权利要求广3中任一项所述的疫苗组合物，其特征在于，还包括疫苗佐剂，所述疫苗佐剂为ISA206、氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆、GelOl、蜂胶、脂质体、ISA760VG中的一种或几种的组合物。6.一种制备权利要求f 5中任一项所述的PPV VP2蛋白的方法，包括如下步骤: 1)进行PPVVP2蛋白基因的TA克隆，获得包含PPV VP2基因的转移载体； 2)回收目的片段，并与PMD-18T载体连接，并转化E.coli DH5 α感受态细胞中，碱裂解法提取质粒，获得的阳性克隆命名为PT-V...

【专利技术属性】
技术研发人员：张许科，孙进忠，白朝勇，
申请(专利权)人：普莱柯生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41