本发明专利技术公开了一种利用生物反应器生产犬细小病毒灭活疫苗的方法，包括以下步骤：(1)应用生物反应器微载体和片状载体系统进行制苗用细胞培养;?(2)接种犬细小病毒并进行病毒扩增培养;(3)收获病毒培养液;(4)病毒液经BEI灭活，加入佐剂制备疫苗。本发明专利技术具有培养细胞密度大、病毒滴度高、质量均一稳定、过程可控和生产效率高的优点，克服了现有转瓶或鸡胚生产工艺产品批间差大、抗原含量低和生产效率低的不足。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于兽用生物制品领域。更具体地，本专利技术涉及一种利用生物反应器工业化生产病毒疫苗的方法。
技术介绍
犬细小病毒病(Canineparvovirus disease, CPVD)是由犬细小病毒(Canineparvovirus,CPV)引起的犬的一种急性传染病。可在犬和猫之间传播，各种年龄的犬都能感染，断奶后的幼龄犬最为易感，传播速度快，发病率和死亡率高达70%以上。自正式报道犬细小病毒病在我国流行以来，该病对我国养犬业造成了极大的危害。给动物接 种疫苗是预防犬细小病毒感染的最有效的方法，目前国内生产犬细小病毒疫苗的方法多采用传统转瓶法或鸡胚生产工艺，但与当前大规模动物疫苗生产不相适应，主要体现在培养病毒滴度低、产品质量不均一稳定、批间差大，生产效率低等。因此，特别需要一种新的均一高效的生产犬细小病毒灭活疫苗的方法。
技术实现思路
本专利技术提供一种利用生物反应器工业化生产犬细小病毒灭活疫苗的方法，该方法是利用生物反应器载体系统培养制苗用细胞，感染病毒后可获得高效价的病毒抗原。该方法较现有的转瓶或鸡胚生产工艺具有病毒滴度高、质量均一稳定、生产效率高、过程可控性好的特点，是今后大规模工业化生产疫苗等生物制品的首要选择和发展方向。本专利技术所采用的技术方案如下一种利用生物反应器工业化生产犬细小病毒灭活疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤I)应用生物反应器微载体和片状载体系统培养制苗用细胞；2)接种犬细小病毒，进行生物反应器扩增病毒；3)收获犬细小病毒的病毒培养液；4)犬细小病毒经二乙烯亚胺(BEI)灭活，加入佐剂制备疫苗。其中，优选的是，本专利技术步骤I)所用的制苗用细胞系为犬肾细胞系MDCK或猫肾细胞系F81。本专利技术步骤2)所接种的犬细小病毒毒株为CPV-2型病毒株。病毒是经过细胞适应性培养而来，具体方法为将犬细小病毒接种制苗用细胞后盲传，即取接种病毒后病毒培养上清按I :3的量接种新鲜培养细胞进行不断传代，待细胞出现典型病变或上清中可明显检测到病毒为止，一般传至3到5代即可，扩增并冻存病毒液作为反应器生产用毒种。本专利技术进一步优选的技术方案是，所用的生物反应器带有Cell-Lift搅拌浆并使用Cytodex系列微载体培养系统；或者所用的生物反应器带有篮式搅拌浆并使用酯片载体系统；或者，所用的生物反应器为一次性激流式生物反应器并使用纸片载体培养系统。其中，Cytodex系列微载体的使用浓度为5_20g/L ;酯片载体使用FibraCel disks圆盘状酯片载体，其使用浓度为200-2000g每批次；纸片载体使用国产一次性聚酯纤维纸片载体，使用量为160g或1200g每批次。本专利技术进一步优选的技术方案是，步骤I)所述的生物反应器培养制苗用细胞工艺包含微载体单级或放大培养工艺，单级培养所用种子细胞为转瓶或细胞工厂培养贴壁细胞，放大培养所用种子细胞为生物反应器微载体系统培养所获细胞。单级培养优选为14L生物反应器单级培养模式，放大培养优选为14L到40L放大培养模式。具体放大方法为将微载体上生长细胞通过胰酶消化装置消化下来以后，连同新的微载体一起导入到新的更大体积的生物反应器中继续培养，依此方法放大到所需生产规模。本专利技术14L到40L放大培养模式采用一种胰酶消化装置消化细胞，避免了大规模消化细胞工艺繁琐及消化时间长的缺点，消化下来的细胞在微载体上重新贴附及生长状态良好。本专利技术进一步优选的技术方案是，步骤I)所述的生物反应器培养制苗用细胞方式为补料分批培养方式或连续灌注的培养方式。其中，生物反应器片状载体系统培养方式优选为补料分批培养方式，生物反应器微载体系统培养方式则优选为灌注培养方式。本专利技术进一步优选的技术方案是，步骤I)所述的生物反应器培养制苗工艺条件 温度为 360C _37°C，搅拌转速为 40RPM -60RPM，溶氧(DO)为 30%_60%，pH 为 7. 0-7. 2。本专利技术进一步优选的技术方案是，步骤I)所述的生物反应器培养制苗用细胞所用的细胞生长液为分别添加5-10%的小牛血清的DMEM/F12、DMEM、MEM或199培养基，在一具体的实施例中，采用的培养基为添加8%的小牛血清的DMEM/F12培养基。在一个具体的实施方式中，本专利技术采用的生物反应器载体培养系统中聚酯纤维纸片载体量160g，接种细胞密度为2-6X 109cells，优选的为2_4X 109cells，接种病毒前总细胞量在2X IOiciceIls以上。在另一个具体的实施例中，本专利技术所使用的Cytodex I微载体浓度为5-20g/L，优选的为6-10 g/L，接种细胞密度为O. 5-2X 106cellS/mL。本专利技术进一步优选的技术方案是，本专利技术的生物反应器培养模式可以是分批培养、补料分批培养、连续培养或灌注培养方式任一。在一个具体的实施例中，本专利技术所采用的制苗用细胞培养模式为补料分批培养方式，在另一个具体的实施例中，本专利技术所采用的制苗用细胞培养模式为连续灌注培养方式。生物反应器扩增病毒可以按任意比例接种犬细小病毒。优选的是，本专利技术步骤2)所述的犬细小病毒接种量按O. 001-0. IMOI进行接种，在更加优选的另一具体实施例中，本专利技术所采用的病毒接种量为O. 01M0I。MOI即病毒感染复数(Multiplicity Of Infection)的英文缩写，直观来讲就是总病毒数与总细胞数的比值，通过取样计数接种病毒前细胞浓度来确定接种病毒量。本专利技术进一步优选的技术方案是，步骤2)所述的病毒培养工艺为补料分批培养或连续灌注培养，采用的病毒维持培养基为原倍的或浓缩了 2-5倍的培养基，更优选为浓缩了 2-3倍的培养基。培养过程中，间歇补加营养物质如葡萄糖、谷氨酰胺、蛋白胨、酵母提取物或乳清蛋白水解物任一或其组合。本专利技术进一步优选的技术方案是，步骤2)生物反应器扩增培养工艺条件为温度为 340C _35°C，搅拌转速为 40RPM-50RPM，溶氧(DO)为 30%_60%，pH 为 7. 2-7. 4。病毒维持培养基为DMEM/F12、DMEM、MEM或199基础培养基的任一之中添加O. 5%_2%的小牛血清，优选的是DMEM/F12基础培养基中添加2%的小牛血清。病毒的收获可以按任一方式收获，本专利技术步骤3)所采用的病毒抗原收获方式依病毒培养方式不同而可以米用不同收获方式。病毒培养方式为补料分批培养时收获病毒可米用分批收获方式，病毒培养为连续灌注培养时收获病毒可采用连续收获方式。灭活是指用物理或化学手段杀死病毒、细菌等，但是不损害它们体内有用抗原的方法。生物制品行业制苗用病毒常用的灭活方法有甲醛灭活、BPL(i3_丙内酯)灭活及BEI (二乙烯亚胺)灭活，甲醛灭活以使病毒的蛋白、核酸变性来达到灭活而保留部分抗原的目的；BPL和BEI灭活是一种新型的病毒灭活方法，仅破坏病毒的核酸而不破坏病毒的蛋白质而达到灭活目的，保持病毒的免疫原性。本专利技术步骤4)所述的病毒灭活方法为BEI灭活，该方式灭活获得的产品具有较好的免疫原性。除非另有说明，本专利技术涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本专利技术涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本专利技术涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用生物反应器工业化生产犬细小病毒灭活疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：1？)应用生物反应器微载体和片状载体系统培养制苗用细胞；2？)接种犬细小病毒，进行生物反应器扩增病毒；3？)收获犬细小病毒的病毒培养液；4？)犬细小病毒经二乙烯亚胺（BEI）灭活，加入佐剂制备疫苗。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李伟，刘洁，秦红刚，漆世华，朱薇，谢红玲，韩兴，王桢桢，王威，温文生，
申请(专利权)人：武汉中博生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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