本发明专利技术公开了一种由两种链球菌菌株制备的水貂链球菌蜂胶灭活疫苗。将所述链球菌菌株接种培养基通气扩增培养，收获培养物灭活后按1∶1比例混合，加蜂胶制备水貂蜂胶链球菌二价灭活疫苗。本发明专利技术所述链球菌蜂胶灭活疫苗用于预防水貂出血性肺炎免疫效果好，可获得至少五个月的保护期，保护率在80％以上，具有良好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种疫苗及其制备方法。
技术介绍
水貂链球菌病是由病原性链球菌引起的一种传染病。在临床上患貂常表现为脓肿型，在头部和颈部发生脓肿。也有的呈现肺炎、肋膜炎、腹膜炎、子宫内膜炎、乳房炎，最后导致败血症。链球菌引起脑膜炎时，常出现一系列的神经症状，行走摇摆，共济失调，有的突然倒地，呈现强直性痉挛，头向后仰，四肢伸展，肌肉紧张。本病潜伏期6-16天。病程短的3小时，长的可达36小时。本病多为散发，很少呈地方流行。链球菌(Streptococcus)是化脓性球菌的一类常见的细菌,属于芽孢杆菌纲，乳杆菌目，链球菌科。水貂链球菌为革兰氏阳性球菌，成对或单个存在，也有呈短链形式存在的，最多的可达到12 14个链状排列，但普遍的排列链较短并且在鲜血平皿上溶血性差，糖发酵反应基本符合链球菌的生化特性。目前，我国对水貂链球病主要采用是抗生素药物治疗。但本病在临床上通过单独投喂或肌注兽药都难以达到良好的治疗效果。而且药物治疗存在一定的缺陷，兽药治疗仅能够减少死亡，使疾病病程延长，一旦停药容易复发，最终由于细菌获得的耐药性及长期投药对动物的伤害，而致动物发病死亡，达不到良好的控制效果。本病只有通过蜂胶疫苗预防或紧急预防和使用敏感抗生素相结合的办法，才能达到良好的预防和治疗效果。因此防治该病发生的有效措施是研制相应的蜂胶灭活疫苗。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种以蜂胶为佐剂的水貂链球菌蜂胶灭活疫苗的制备方法，使其免疫水貂后副作用小，对毛皮质量影响小，免疫产生时间早，免疫力强，免疫期长。具体实施步骤 步骤I :将链球菌2型SQNl株和SQN2株分别接种于发酵培养基培养，调整菌数为200-250亿CFU/mL按比例I :1混合； 步骤2 :灭活步骤I所得混合培养物；步骤3 :在步骤2所得培养物中添加蜂胶佐剂，即得所述水貂链球菌蜂胶灭活疫苗。作为优选，步骤I所述接种为按发酵培养基体积的2%接种菌株。作为优选，步骤I所述培养为在37°C通气搅拌培养12_16h，控制链球菌的培养时间在16h以内，防止培养时间过长导致链球菌外毒素的产生，更好地保障疫苗安全性。作为优选，步骤2所述灭活为用终浓度O. 5%的甲醛灭活，于37°C灭活24h。作为优选，步骤3所述佐剂为蜂胶溶液。本专利技术所述链球菌2型SQNl株和SQN2株混合制成的水貂链球菌蜂胶灭活疫苗，一次可达到80%以上保护率，免疫期可达到五个月，其制备工艺简单，适合商品化生产，具有良好的应用前景。具体实施例方式发酵培养基蛋白胨2%，牛肉膏O. 6%，氯化钠O. 5%，葡萄糖O. 5%，用去离子水配成，配完调PH值7. 4-7. 6，112°C 30min,灭菌后按照培养基的2%加入健康胎牛血清。实施例I 疫苗制备将于中国兽医药品监察所菌种室购买的链球菌2型SQNl株和SQN2株用营养肉汤溶解后，分别接种于斜面培养基上，37 V培养24小时，取培养物分别划线接种于鲜血琼脂平板上，37°C培养16-18小时，经纯检合格后，作为一级种子，分别接种于含O. 3%牛肉膏和2%胎牛血清的营养肉汤培养基，37°C培养16-18小时，取样经纯粹检验合格后，作为二级种子，将二代种子按2%比例接种于发酵罐，按发酵罐容积总量装入70%的发酵培养基与O. 01%的消泡剂，搅拌速度为150转/分，37°C培养16-18小时，即为培养好的疫苗菌液，分别取样用适宜培养基进行纯粹检验，同时取样进行活菌计数，调整每种菌液含活菌数为20-25亿CFU/mL，之后将菌液按菌株SQNl和SQN2株比例为I: I混合，混合后加终浓度为O. 5%的甲醛37°C灭活24h。疫苗灭活检验将甲醛灭活后的菌液取100微升接于3ml液体培养基中，一次培养取三次样，每个样品接种于三个试管中观察五天进行灭活安全检验，五天后接种的液体培养基仍澄清无混浊则安全检验合格。2.佐剂原液的制备 选取购自山东临清市清坤蜂蜡巢础加工厂已知纯度的蜂胶，经破碎后过筛，溶于95%的乙醇溶液，再根据要求配成适当浓度的溶液于4°C下保存备用。成品疫苗制备按每ml疫苗含蜂胶干物质含量为8 15mg标准添加蜂胶溶液搅拌15 20分钟，使其充分混合乳化。实施例2 将实施例I制备好的三批疫苗单剂量、单剂量重复和超剂量注射健康水貂，后肢内侧肌肉接种。通过14d观察，接种水貂体温和食欲正常，接种局部无肿胀和炎症，未出现局部和全身反应每批疫苗选择3只，剖杀后切开注射部位皮肤观察注射局部病理变化，水貂接种部位皮下无异常变化，后肢内侧肌肉接种部位肌肉组织正常，仅见到注射部位呈深褐色，有玉米粒大小，与周围红褐色肌肉相区别，注射部位未见炎症反应。60-70日龄幼貂继续观察至接种后30d，幼貂发育良好。说明疫苗对不同年龄的水貂具有较好的安全性。实施例3 三批水貂链球菌蜂胶灭活疫苗分别免疫16_18g小白鼠20只，实验组和对照组各10只，O. 2mL/只，免疫后21d连同对照组小白鼠20只分别用ZC株、RC株攻毒，观察7日，三批疫苗免疫组小白鼠均100%获得保护，对照组小白鼠均100%发病。三批水貂链球菌蜂胶灭活疫苗分别免疫2-10月龄的健康水貂，每批疫苗肌肉接种水貂10只，ImL/只，免疫后21日连同对照组水貂10只分别用SQNl株和SQN2株，通过气管内滴入攻毒(每个组别5只)，观察7日，三批疫苗免疫组水貂均100%获得保护，对照组水貂均100%发病。 实施例4 采用三批蜂胶灭活疫苗进行免疫保护期测定。分为实验组和对照组，实验组分六组，每组30只水貂，用本专利技术所述三批蜂胶灭活疫苗免疫，每批疫苗免疫10只水貂，每后肢内侧肌肉注射ImL ;对照组分为六组，每组10只水貂，后肢内存肌肉注射生理盐水对lmL，免疫后的第1-6个每月用SQNl株和SQN2株分别攻毒(每株接种5只水貂)，分别测定疫苗对这两种毒株的保护力。实验结果表明，本专利技术所述蜂胶灭活疫苗对水貂抗链球菌SQNl株的保护期为6个月，免疫保护率在80%以上，对水貂抗链球菌SQN2株的保护期5个月，免疫保护 率在80%以上。权利要求1.一种水貂链球菌蜂胶疫苗，其特征在于主剂为购自中国兽医药品监察所菌种室的链球菌2型SQNl株和SQN2株，佐剂为蜂胶。2.根据权利要求I所述的疫苗，其特征在于疫苗浓度为含菌量200亿CFU/ml，含蜂胶干物质10 15mg/ml。3.权利要求I所述的水貂链球菌蜂胶疫苗的制备工艺，其特征在于所述的制备工艺包括如下步骤 1)制备菌液； 2)制备蜂胶液； 3)配置疫苗，取菌液保存液与蜂胶保存液混合成黄色混悬液，分装后密封保存。4.根据权利要求3所述的制备工艺，其特征在于制备菌液步骤主要由下述步骤完成将链球菌2型SQNl株和SQN2株加入到培养基中，37°C培养16-18小时，调整到菌液浓度为20亿 25亿活菌/ml，再加入甲醛溶液使最终浓度为O. 5%，放在37°C中灭活24小时制成灭活菌苗备用。5.根据权利要求3所述的制备工艺，其特征在于制备蜂胶液步骤主要由以下步骤完成选取已知纯度的蜂胶，经破碎后过筛，溶于95%的乙醇溶液，再根据要求配成适当浓度的溶液于4°C下保存备用。6.根据权利要求3所述的制备工艺，其特征在于黄褐色混悬液，密封保存于4-8°C本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：单虎，张传美，秦晓冰，秦志华，杨瑞梅，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：
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