本发明专利技术涉及基因工程领域，尤其涉及一种兔出血热病毒空衣壳抗原的制备方法。根据本发明专利技术的方法包括以下步骤：1)构建包含兔出血热病毒衣壳蛋白VP60基因或优化基因的杆状病毒转移载体，其中，是按家蚕的密码子频率进行密码子优化；2)将构建得到的转移表达载体与杆状病毒DNA进行共转染，以发生同源重组或转座，获得重组杆状病毒；3)将重组杆状病毒感染昆虫宿主细胞；4)培养被感染的昆虫宿主，表达相应的兔出血热病毒空衣壳抗原，收获并纯化所表达的抗原。本发明专利技术方法可以大幅度降低兔出血热病毒空衣壳抗原的生产成本，具有安全、高效、能耗少、成本低等诸多优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，尤其涉及。
技术介绍
兔病毒性出血症俗称兔癌，是由兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)引起的一种急性、烈性、高度接触性、致死性传染病，曾是兔的一种毁灭性传染病，因给养兔业带来巨大的经济损失而备受养兔业的关注。1984年中国首次报道了该病。 1989年，世界动物卫生组织(OIE)将该病正式列为B类传染病，我国将其列为二类传染病 (王永坤等，兔瘟的诊断与防治，1992)。在2000年国际病毒分类委员会(ICTV)的第七次报告中，将兔出血热病毒列入了杯状病毒科(Caliciviridae)兔病毒属(Lagovirus)。RHDV病毒粒子呈球形，无囊膜，直径32-36nm，20面体对称(张丽红等，广东畜牧兽医科技，31 :9_11，2006)，其衣壳由32个高 5-6nm的圆柱状壳粒构成，由主要结构蛋白VP60多重拷贝所组成。负染电镜表面具有嵌杯样病毒典型的杯状形态结构，电镜下还可见少数没有核心的病毒空衣壳。RHDV基因组含2个开放阅读框，5’末端的长开放阅读框架(ORFl)编码一个2344 氨基酸的多聚蛋白前体，它被病毒蛋白酶进一步分解为衣壳蛋白和多个非结构蛋白，其中衣壳蛋白为病毒的主要结构蛋白，称为VP60，与诱导抗病毒感染的免疫反应直接相关。3’ 末端的短开放阅读框架(0RF2)，位于7025-7378bp之间，编码病毒另一个小的结构成分，称为 VP10。VP60的N-端组成衣壳蛋白的内部区，C-端组成衣壳蛋白的外部。N-端的第 31-250之间的氨基酸是主要的抗感染免疫决定区。对VP60蛋白的研究发现，体外表达该衣壳蛋白时，在没有其他任何成分存在的条件下，可自然聚合成不包裹核酸的、与天然RHDV 病毒粒子在物理形态上类似的病毒样颗粒(Rob N,Virus-like particle as immunogens, Trends in Microbiology, 11 :438-444,2003) 近年来，应用病毒样颗粒作为疫苗的抗原载体越来越受到广大科学家的重视。病毒样颗粒是模拟病毒的颗粒形态特点，将外源基因片段产物呈递到病毒颗粒表面而形成的嵌合颗粒，它的外部形态与病毒颗粒相同，甚至还有某些病毒受体的天然配体，同时，还可将其他病原的特异性抗原等呈递在自己的表面，因而在病原体的疫苗研究中发挥着重要的作用。VLPs常可以诱导产生较灭活疫苗和可溶性多肽更为强烈的体液免疫应答，因为其表面是以非感染性的颗粒状态模拟天然抗原呈递过程来呈递糖蛋白抗原的，而该法提呈引起的免疫应答优于溶解状态，故在保护作用中起重要作用的糖蛋白抗原引起的免疫应答可望更接近自然感染，这样，病毒样颗粒更有可能广泛用于疫苗的研制。而且，VLPs由于不包裹核酸，不能复制，因此也没有感染性，是一种安全的抗原载体(Nagesha H S，Virus-like particles of calicivirus as epitope carriers, Arch Virol, 144 :2429-2439,1999)。大量的实验表明，RHDV不能在鸡胚上增殖，也难于在各种原代或传代细胞中稳定增殖。目前广泛使用的疫苗为组织灭活苗。近来，新型疫苗的研究主要集中在基因工程苗的研制上，已在大肠杆菌、酿酒酵母、痘苗病毒以及植物等多种表达系统中表达了 VP60蛋白(刘怀然等，动物医学进展，24:7-9，2003)。Boga等在大肠杆菌中表达了 RHDV西班牙 AST/89株的主要衣壳蛋白VP60，发现当VP60以β -半乳糖苷酶融合蛋白表达时，仅与天然 VP60拥有部分相同抗原并不诱导产生保护性免疫；而在以T7RNA聚合酶为基础的表达系统中则可表达与天然VP60抗原性极为相似的蛋白质并可诱导产生有效的保护性免疫，能抵抗住提纯RHDV的致死性攻击；Boga等在酿酒酵母中表达VP60并能形成病毒样颗粒；Famos 等将Spanish isolate AST/89的VP60在酵母中进行高效表达，蛋白表达量高达1. 5g/L且大约70%表达蛋白进行了糖基化修饰；严维巍等将RHDV VP60基因插入pPICZ B经毕赤酵母表达的重组蛋白具有血凝特性且可被抗RHDV的高免血清所抑制(严维巍等，中国兽医学报，23 =447-449, 2003)。！^ernandez-Femandez等采用洋李痘马铃薯Y病毒构建的载体成功表达了 VP60，该表达产物接种兔能抵御致死剂量RHDV的攻击O^ernandez-Fernandez M R， Protection of rabbits against rabbit hemotthagic disease virus by immnization with the VP60 protein expressed in plan ts with a potyvirusbased vector, Virology, 280 :283-291, 2001) ；Castanon等采用马铃薯表达含VP60的抽提物对兔进行免疫，产生特异的抗体反应并可提供对RHDV强毒攻击的保护(Castanon S,The effect ofthe promoter on expression of VP60gene from rabbit hemorrhagic disease virus in potato plants, Plant Science, 162 :87-95,2002)。目前，RHDV基因工程疫苗研究仍然存在一些问题大肠杆菌表达的VP60具有不可溶性及免疫效果相对较差的缺点，其应用前景并不乐观；重组病毒疫苗存在向环境扩散经遗传修饰的生物体安全问题；采用转基因植物生产VP60的表达水平目前还不理想；因而研制RHD安全、高效的新型疫苗势在必行。兔瘟以呼吸系统出血，实质器官水肿、淤血及出血变化为特征，感染兔常在48-72 小时内死亡。根据病变特点可作出初步诊断，结合实验室检测病死兔组织中的病毒抗原进行确诊，主要用血凝实验(HA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫电镜技术及分子生物学方法。昆虫杆状病毒表达载体系统(BEVQ自1983年建立以来(Smith，Mol. Cell Biol.， 3 :2156-2165,1983)，已有近千种外源基因在该系统中得到表达。其优点为A :BEVS表达效率高，表达产物的生物活性高，其抗原性、免疫原性均与天然蛋白相似；B 家蚕杆状病毒能容纳较大的外源基因而不影响其本身的增殖；C 应用晚晚期多角体蛋白基因启动子表达外源基因，即使重组基因产物对细胞有毒性，也不影响表达水平；D 借多元表达载体或借几个不同重组病毒共感染，可以同时表达2个或更多个外源蛋白，研究肽链超分子装配以及蛋白寡聚体的结构与功能；E 杆状病毒对脊椎动物无病原性，家蚕没有与人畜共患的疾病，被认为遗传学上是安全的表达载体(景志忠等，中国兽医科技，31 :43-45，2001)。家蚕BmNPV表达系统(家蚕生物反应器)自1984年开发以来已在医学、兽医学和农业上得到广泛的应用。1997年，田鄂等以修饰的BmNPV为载体，在家蚕细胞和幼虫中成功表达了日本血吸虫中国大本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种兔出血热病毒衣壳蛋白ＶＰ６０优化基因，其特征在于，其核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张志芳，李轶女，易咏竹，王树坤，石小峰，王石宝，张渭蛟，舒惠国，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：11
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