本发明专利技术涉及病毒诊断，特别是非洲淋巴瘤病毒（ＥＢＶ）的诊断，证实ＥＢＶ的方法和适当的手段。本发明专利技术还涉及衍生自ｐ１８－ＶＣＡ的肽，所述肽得以将急性感染从过去的ＥＢＶ感染中区分开。所述ｐ１８－ＶＣＡ衍生的肽的特征在于它们比ｐ１８病毒抗原的Ｎ末端少最多１００、特别是１０－７０个氨基酸。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及病毒诊断领域，特别是非洲淋巴瘤病毒(Epstein-Barr virus，EBV)的诊断。提供了检测EBV感染的改进的方法和适用于这一目的的试剂。非洲淋巴瘤病毒是一种人疱疹病毒，被认为是传染性单核细胞增多症的触发物。EBV感染经常是临床症状不明显地发生，偶然具有轻微的症状。然而，在免疫抑制的个体中，EBV感染可导致严重的恶性表现。非洲淋巴瘤病毒(EBV)诊断的重要性EBV诊断有相当不同的诊断重要性，因为急性EBV感染的症状可能与许多由其他病原体导致的或具有其他原因的临床表现交叠。因而，急性EBV感染可能与原发的HIV感染、风疹病毒感染、巨细胞病毒感染、典型肝炎病毒的感染、弓形体病、钩端螺旋体病、各种嗜神经性病原体的感染和与白血病或淋巴瘤相混淆。明确的EBV血清学因此成为为病人服务的主要目标。EBV血清学的难题典型的EBV血清学是基于对病毒衣壳抗原(VCA)和EBV特异性核抗原(EBNA)，特别是EBNA-1的IgG和IgM抗体应答的检测。各种EBV抗原种类的分类是基于病毒增殖的生物周期，针对早期(EA)和晚期(VCA)所需的蛋白和用于维持潜伏性的抗原(EBNA)来进行。这些抗原种类在最初的血清学测试系统(用EBV感染的细胞进行免疫荧光)中是可检测的和可区分的。血清学测试系统的所有随后的进一步改进都保持了这个方案，因而容许对针对EBNA、VCA和EA的抗体特异性进行区分。VCA和EBNA标记物是首先在免疫荧光检验技术中定义的。在更新近的测试中，使用了VCA复合物的纯化组分p18和p23(其通常通过重组方法制备)和相应于EBNA-1的p72。EBNA-1抗原在随着潜伏感染细胞的建立而进行的初期感染之后的晚期阶段形成，是负责维持这个阶段的因子之一。这意味着抗-EBNA-1只在初期感染之后超过6个月才会形成。然而同时，这也意味着当出现这一标记物时，诊断中可安全地排除新近感染，因而可以获得用于确定感染时间的重要标记物。EBV血清学具有高度的易变性，如果仅确定了典型的标记物VCA-IgG、VCA-IgM和抗-EBNA-1，常常导致不明确的或错误的结果。因而，例如，不是所有的急性EBV感染都具有可检测的VCA-IgM反应，因此在这种情况中仅基于确定VCA-IgG和VCA-IgM的测试策略导致了错误的结论。另一方面，在少数病例中VCA-IgM也可持续数月的时间，从而冒充了新近感染。阳性的抗-EBNA-1是过去的EBV感染的证据，与阳性VCA-IgG结合，是唯一明确的血清学状况。阴性的抗-EBNA-1(同时具有阳性VCA-IgG)既可表明急性EBV感染，又可由免疫抑制情况下的继发性抗-EBNA-1丧失而导致。此外，约5％的感染者从不出现可检测的抗-EBNA-1，从而在他们一生中都冒充了急性EBV感染的血清学状态。因而，通过同时具有阳性VCA-IgG和抗-EBNA-1，安全地排除了急性EBV感染。然而，阳性VCA-IgG和阴性抗-EBNA-1表现出不明确的构象，其在三种状态下发生1)在新近EBV感染的情况中；2)在过去的感染和细胞免疫系统抑制导致的抗-EBNA-1丧失的情况中；3)在过去的感染和同时缺乏抗-EBNA-1形成(在约5％的健康人群中)的情况中。例如，发现状态2)和3)在大医院检查的患者中比真正的新近EBV感染更加频繁。这个EBV血清学的关键问题到目前为止仅可以通过复杂的额外测试或通过在较长时间内与临床数据相关联的重复来可靠地解决。因此，缺乏抗-EBNA-1通常用作新近感染的指示。如上所述，这可在感染EBV的人群的情况中导致极端的错误判断，该感染EBV的人群维持了抗-EBNA-1阴性，或由于细胞免疫系统的抑制丧失了相关的抗体。当前在常规诊断中使用和应用抗-EBNA-1的方法不能安全地进行新近EBV感染的诊断。因此，EBV血清学的主要难题是一方面在急性EBV感染中区别原发性抗-EBNA-1阴性，和另一方面抗-EBNA-1的丧失和缺乏抗-EBNA-1形成，这个特别的难题在大多数公开的对血清学测试的评估中都没有被考虑到。必须假定，高达20％的EBV感染检查是不明确的并导致错误的发现。这些特别是在肿瘤学、移植医学和孕期照料中是最重要的。本专利技术的一个目的是提供用于检测EBV感染的试剂，其能允许安全地区分急性感染和以前的感染。令人惊讶地，发现通过修饰病毒EBV衣壳抗原p18，有可能得到与抗体反应的肽，所述抗体以与抗-EBNA-1类似的确定性仅在感染后的晚期阶段形成，并且不在相同程度上表现出在免疫抑制人群中的不形成(nonformation)或丧失的问题。这些是衍生自EBV-p18抗原的肽，EBV-p18抗原由阅读框BFRF3编码。这个抗原早在1988年就已被描述为VCA标记物(Middeldorp和Herbrink，J.Virol.Meth.，21(1988)133-146)。p18的分子排布和通过遗传工程方法制备蛋白、以及其特定免疫学活性片段的用途已经在EP 574 075 A2中描述。然而，对重组抗原或对化学合成的片段的性质的描述总是基于最佳的反应性的。针对由重组方法制备的纯化的完整p18抗原的IgG抗体，即使在新近EBV感染的情况中也是可检测的，因此不适于分辨急性感染和以前的感染。令人惊讶地，在研究的过程中发现，例如，通过删除p18抗原的N-端区域，可以达到随时间区分抗体反应删除N-末端的p18可识别感染后仅数周形成的抗体。因此，本专利技术涉及衍生自非洲淋巴瘤病毒的病毒p18抗原的肽，其中所述肽能与来自已有相对长时期前的非洲淋巴瘤病毒感染的个体的抗体反应，但不与或微弱地与来自有急性非洲淋巴瘤病毒感染、或近期有非洲淋巴瘤病毒感染的个体的抗体反应。“肽”的表述包括寡肽和多肽。肽的长度没有限制，除非进行了声明。根据本专利技术的肽是修饰的p18抗原，即，它与“野生型蛋白”病毒p18不完全相同。相对于病毒p18的修饰没有特别的限制，只要修饰的肽与这样的抗体反应，所述抗体来自已有相对长时期前的EBV感染的个体，但不与或微弱地与那样的抗体反应，所述抗体来自有急性EBV感染的个体、或来自有近期的EBV感染的个体。根据本专利技术的肽衍生自p18的事实意味着其包含具有完整病毒p18抗原的至少一个表位的至少一个片段。如果在对用血清孵化进行的行分析(lineassay)中(对照，实施例3)获得了阳性反应，则存在这种表位，所述血清来自已有相对长时期前的EBV感染的个体。病毒的p18的氨基酸序列在附图7中示出(SEQ ID NO1)。通常，根据本专利技术的肽具有与SEQ ID NO1不同的氨基酸序列。它优选的包含一个或多个删除和/或替换。最优选的，根据本专利技术的肽与SEQ ID NO1所示的氨基酸序列相比具有一个或多个删除。氨基酸可在p18的N-末端删除，但也可在p18序列的C-末端和/或在内部位置删除。优选的，删除p18序列的N-末端的一个或多个氨基酸。根据本专利技术的肽包含、或由氨基酸序列SEQ ID NO1的至少10个连续氨基酸组成，优选的至少25个，更优选的至少50个，进一步优选的至少75个，进一步优选的至少100个，最优选的至少125个氨基酸序列SEQID NO1的连续氨基酸。优选完整p18-VCA的至少一个表位不存在于本本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种衍生自非洲淋巴瘤病毒的病毒ｐ１８抗原的肽，其中所述肽与来自己有相对长时期前的非洲淋巴瘤病毒感染的个体的抗体反应，但不与或微弱地与来自有急性非洲淋巴瘤病毒感染、或近期的非洲淋巴瘤病毒感染的个体的抗体反应。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：曼弗雷德莫茨，乔格鲍尔，欧文索奇克，
申请(专利权)人：米克罗根分子生物技术发展有限责任公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]
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