本发明专利技术公开一种利用昆虫细胞High?Five进行柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)及其重组病毒的增殖培养和克隆筛选。High?Five细胞生长速度较快，贴壁较好，通过High?Five细胞筛选病毒，柞蚕蛹体内扩增病毒，可以较快速的实现重组病毒的筛选，在利用我国丰富的柞蚕蛹资源，开发生物、农业、医药卫生以及相关科研产品等方面有广阔的应用前景，且能够有效提高柞蚕业的产值，增加农民收益。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开一种利用昆虫细胞High?Five进行柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)及其重组病毒的增殖培养和克隆筛选。High?Five细胞生长速度较快，贴壁较好，通过High?Five细胞筛选病毒，柞蚕蛹体内扩增病毒，可以较快速的实现重组病毒的筛选，在利用我国丰富的柞蚕蛹资源，开发生物、农业、医药卫生以及相关科研产品等方面有广阔的应用前景，且能够有效提高柞蚕业的产值，增加农民收益。【专利说明】昆虫细胞H i gh Five在培养柞蚕核型多角体病毒中的应用
本专利技术属生物
，具体涉及利用昆虫细胞High Five进行柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)增殖培养和克隆筛选。
技术介绍
我国是世界上柞蚕第一生产大国，柞蚕茧年产量在7万吨左右，生丝及制成品年出口创汇2亿美元。随着市场需求的变化和技术的不断进步，柞蚕的经济价值由过去单一的茧丝经济向茧丝+蚕蛹的经济模式转变。柞蚕以蛹期滞育越冬，可长期保存，并且蛹个体大，可开发成为高效、低廉的生物反应器，从而提高柞蚕蛹的利用价值，这对柞蚕产业的发展有重要意义。在前期的研究中，我们利用昨蚕核型多角体病毒(Antheraea pernyimultinucleocapsid nucleopolyhedrovirus, ApNPV)建立了作香病毒表达载体系统，并在柞蚕蛹体中成功地表达了绿色荧光蛋白，为柞蚕蛹生物反应器的建立及开发应用奠定了基础。利用柞蚕病毒表达载体系统进行基因表达及产品开发，其中一个重要的技术环节是使ApNPV病毒能够感染体外培养的昆虫细胞，并在细胞中增殖。因此，一个对ApNPV敏感的昆虫细胞株(系)对这一系统的应用是必不可少的。我们曾建立了对ApNPV敏感的樗蚕(Philosamia cynthia, Pc)细胞系Pc-Ol,并利用这一细胞系成功地筛选了可表达绿色突光蛋白的重组病毒ApNPV-Λ ph/egfp+。Pc-Ol是目前发表的唯一可以被ApNPV感染的细胞，属于半贴壁细胞，细胞分生速度慢，传代周期长，影响重组病毒的筛选进程。因此，寻找可贴壁生长、分生速度较快、可被ApNPV感染的细胞是十分必要的，以解决表达系统存在的不足。High Five(BT1-TN-5Bl-4)细胞是源自于粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的昆虫细胞株(Davis et al.，1992`)，目前已商业化。High Five细胞可用无血清细胞培养基SF-900TM II SFM或完全TNM-FH培养基进行连续传代培养，群体倍增时间18-24小时，细胞可贴壁生长。High Five 可感染 AcNPV (Autographa califomica nuclear polyhedrosisvires, AcNPV)病毒，并形成病毒空斑，主要用于AcNPV表达载体的重组蛋白表达(Growthand Maintenance of Insect Cell Lines, user guide, Cat#B855_02, Invitrogen)。虽然病毒分类上认为AcNPV和ApNPV同属于昆虫杆状病毒，但它们的细胞宿主有很大差别。AcNPV可感染的细胞宿主较多，包括High Five、Sf9和Sf21等昆虫细胞，但并不感染Pc-Ol细胞，也不能感染柞蚕蛹；而ApNPV的细胞宿主专一，仅能够感染Pc-Ol细胞及柞蚕，对Sf9和Sf21细胞均不感染。目前尚没有High Five细胞用于ApNPV感染的相关研究报道。
技术实现思路
为了解决柞蚕核型多角体病毒表达载体系统存在的不足，本专利技术首次利用昆虫细胞High Five进行ApNPV的感染、增殖及克隆。High Five细胞生长速度较快，贴壁较好，有利于病毒的筛选。通过High Five细胞筛选病毒，柞蚕蛹体内扩增病毒，可以较快速的实现重组病毒的筛选。本专利技术的一方面在于保护昆虫细胞High Five在培养柞蚕核型多角体病毒中的应用。所述的柞蚕核型多角体病毒不仅限于自然界分离的野毒株，还包括经过基因重组的柞蚕核型多角体病毒。对于本专利技术所述的上述应用，优选的方案是,利用昆虫细胞High Five进行昨蚕核型多角体病毒或其重组病毒的感染、增殖；或利用昆虫细胞High Five筛选柞蚕核型多角体重组病毒。其具体方案如下:本专利技术上文所述的技术方案中，所述的柞蚕核型多角体病毒或其重组病毒在HighFive细胞中的增殖方法为:(1)High Five细胞用完全ΤΝΜ---培养基进行传代培养至对数生长期，然后用吸管轻轻吹打，制成约0.5~1XlO6Ail细胞悬液，再转至细胞培养板中，28°C培养1~2小时，使细胞密度占培养板的80%左右；(2 )将柞蚕核型多角体病毒或其重组病毒样品，用昆虫无血清细胞培养基SF-900?II SFM,按1:100的体积比稀释，过滤除菌后获得柞蚕核型多角体病毒或其重组病毒的病毒液；(3)将步骤(1)制备的High Five细胞中的培养基弃去,加入等体积的步骤(2)制备的柞蚕核型多角体病毒或其重组病毒的病毒液；静置28°C培养箱中I小时；(4)将步骤(3)制备的病毒液弃去，加入二倍体积的完全ΤΝΜ---培养基，28°C培养72~96小时。利用上述方法，本专利技术的实施例中的数据表明，柞蚕核型多角体病毒或其重组病毒(ApNPV-Δ ph/egfp+)在High Five细胞中能够有效增殖，能够在显微镜下观察到被感染细胞中病毒包含体的形成，或在荧光显微镜下观察到被感染细胞中产生的绿色荧光。本专利技术上文所述的技术方案中，所述的柞蚕核型多角体重组病毒在High Five细胞中的筛选方法为:(a)将有重组病毒和野生病毒混合感染的柞蚕蛹体液，用昆虫无血清细胞培养基SF-900? II SFM按照1:100的体积比稀释，过滤除菌；再将此无菌病毒液10倍梯度稀释，配制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7不同浓度病毒液；(b)分别取步骤(a)制备的梯度稀释的病毒液感染High Five细胞，1小时后弃去病毒液，加入等体积的2%的低熔点琼脂糖，待其凝固后，加入等体积的完全TNM-FH培养基，28°C培养4~5天，显微镜下观察病毒发生情况；(C)取出上层培养液，选最低病毒浓度感染的细胞孔，用玻璃吸管将个别感染有标记的野生病毒的细胞挑出。将其余的细胞悬浮在少量细胞培养基中，振荡离心后取上清，注射感染柞蚕蛹，每头50~lOOul，置22°C，10~12天。使重组病毒得到繁殖扩增，用显微镜观察或PCR检测方法分析筛选病毒的纯度。如需要，可重复此步骤再进行一轮病毒筛选。本专利技术的实施例中，利用柞蚕核型多角体病毒表达载体系统进行犬干扰素基因的重组病毒的构建和表达，其试验结果有效的证明，经重组病毒感染后，不论是在柞蚕蛹体液，还是在柞蚕蛹组织中均可检测到犬干扰素基因的表达。证明昆虫细胞High Five可用于柞蚕核型多角体病毒及相关重组病毒的培养和筛选。也能够利用High Five细胞-柞蚕蛹或柞蚕幼虫实现柞蚕核型多角体病毒及其重组病毒较快速的扩增。在利用我国丰富的柞蚕蛹资源，开发生物、农业、医药卫生以及相关科研产品等方面有广阔的应用前景。一旦得到广泛应用，将有助于提高柞蚕业的产值，增加农民收本文档来自技高网...
【技术保护点】
昆虫细胞High?Five在培养柞蚕核型多角体病毒中的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：范琦，赵振军，王林美，叶博，岳冬梅，张波，李树英，
申请(专利权)人：辽宁省农业科学院大连生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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