从蛹虫草固体培养基残基中提取虫草多糖的方法技术

本发明专利技术公开一种从蛹虫草固体培养基残基中提取虫草多糖的方法，依次按照如下步骤进行：将新鲜蛹虫草固体培养基残基干燥成粉用高压均质机破碎制成浆料；按培养基残基粉质量的2%加纤维素酶，在50℃下搅拌酶解3h，然后按培养基残基粉质量2%加果胶酶，常温酶解6h；将酶解液升温至65℃搅拌2h，常温离心，收集上清；按照上清液质量的2%加淀粉酶，于55℃下搅拌酶解6h；按照溶液体积0.8%加入ZTC 1+1天然澄清剂B组分的1%粘胶液，搅拌1h后按体积0.4%加入ZTC 1+1天然澄清剂A组分的1%粘胶液，搅拌1h后，离心，收集上清溶液；醇沉取沉淀；将沉淀溶解后干燥成粉得到虫草多糖。

【技术实现步骤摘要】
从蛹虫草固体培养基残基中提取虫草多糖的方法
本专利技术涉及一种从蛹虫草固体培养基残基中提取虫草多糖的方法，尤其是一种操作简单、得率及纯度高且无污染的从蛹虫草固体培养基残基中提取虫草多糖的方法。
技术介绍
蛹虫草，又名北冬虫夏草、北虫草等，为冬虫夏草属（Cordyceps）真菌，可寄生于鳞翅目、鞘翅目、双翅目等昆虫的幼虫或蛹体上。研究显示，蛹虫草有效化学成分的种类及含量与冬虫夏草相同或相似，但与冬虫夏草苛刻的生长条件不同，对生长环境的要求较低，可采用人工发酵培养。蛹虫草培养分为固体发酵培养和液体发酵培养，其中固体培养是采集野生的蛹虫草进行菌种的分离、纯化后接种在大米、小麦或活蚕蛹体等固体培养基上，在一定的温度、湿度和光照条件下培养35～45d得蛹虫草子实体，而蛹虫草固体培养基残基中则含有大量虫草素、粗蛋白、粗多糖、维生素及必需氨基酸等，蛹虫草多糖是蛹虫草固体培养基残基中最重要的活性成分之一。蛹虫草多糖除是良好的免疫促进剂外，还具有保肝护肝、抗肿瘤、抗氧化、降血糖及抗辐射等作用，目前已有以蛹虫草固体培养基残基为原料提取蛹虫草多糖的相关报道。如中国专利号为201110086808.2的专利技术专利公开了一种从蛹虫草培养基中提取多糖的方法，中国专利号为201410002259.X的专利技术专利公开了一种从废弃蛹虫草培养基质中提取虫草基质多糖的方法及其提取物的应用。所述专利均采用酶解法对培养基中的蛹虫草粗多糖进行温和提取，但在除去蛋白时却采用了不同的方法。中国专利号为201110086808.2的专利技术专利采用如下两种方法：a.所述沉淀状蛹虫草粗多糖配置成2～10％的溶液，在4℃条件下缓慢加入10％三氯乙酸溶液，体积比为5：1，搅拌；在4℃条件下振摇10分钟后，在4℃条件下高速离心10分钟，取上清液重复以上脱蛋白步骤数次，至多糖溶液中福林酚法检测蛋白含量为0.5％；而后向溶液中加入4.5倍体积95％的乙醇醇沉12～16小时，高速离心，取沉淀，配成3～5％的多糖液，在截留分子量为7000Da～8000Da的透析袋内透析48～72小时，透析后，袋内液浓缩，冷冻干燥得精制虫草多糖；b.所述沉淀状虫草粗多糖配置成2～10％的溶液，加入溶液重量的0.05～1％的胃蛋白酶，用6mol/L的HCl调pH1.5～3.0，在37℃条件下酶解1～6小时；而后于90～98℃灭酶10分钟，冷却至室温，用NaOH溶液调至中性，离心10分钟，取上清液，加入3～4.5倍体积95％乙醇，在0～4℃的温度下，醇沉12～16小时；离心，取沉淀，配制成2～5％的溶液，以体积比为4～5：1的比例加入氯仿与正丁醇体积比为4～5：1的Sevag试剂，剧烈振摇20分钟，静置30分钟，离心除去沉淀，取上清液重复以上脱蛋白步骤数次，至多糖溶液中福林酚法检测蛋白含量至0.5％；而后向溶液中加入4.5倍体积95％的乙醇醇沉12～16小时，高速离心，取沉淀，配成2～5％的多糖液，在截留分子量为7000Da的透析袋内透析48～72小时，透析后，袋内液浓缩，冷冻干燥得精制虫草多糖。中国专利号为201410002259.X的专利技术专利则采用如下方法：3）……随即加入一定量的蛋白酶，调节到适宜的pH值后，40~60℃继续酶解1~3小时；4）醇沉将步骤3）中所得的酶解液加热到90~98℃灭酶，后取上清液加入95%的乙醇，在低温下醇沉，4500r/min离心并冷冻干燥，得到沉淀的虫草粗多糖粉末；5）进一步纯化将步骤4）所得多糖提取物粗品适量用色谱柱纯化，用苯酚硫酸法跟踪馏分，收集主峰合并后，加入95%乙醇，冰浴放置，过滤，将沉淀物进行冷冻干燥或者在常温下进行真空干燥，得到白色的虫草单一组分多糖提取物；以上三种方法均存在着操作复杂、化学试剂用量多的问题，继而费时费力，污染环境，提取成本高，不适用于工业化生产。
技术实现思路
本专利技术是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种操作简单、得率及纯度高且无污染的从蛹虫草固体培养基残基中提取虫草多糖的方法。本专利技术的技术解决方案是：一种从蛹虫草固体培养基残基中提取虫草多糖的方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：a.将新鲜蛹虫草固体培养基残基干燥，粉碎为至少60目，得蛹虫草固体培养基残基粉；b.按照1:10体积比加水，用匀浆机匀浆后用高压均质机破碎制成浆料；c.按照蛹虫草固体培养基残基粉质量的2%加酶活力为1万U/g的纤维素酶，在50℃下搅拌酶解3h，然后按原料质量2%加酶活力为3万U/g的果胶酶，常温酶解6h；d.将酶解液升温至65℃搅拌2h，常温离心，收集上清；e.按照蛹虫草固体培养基残基粉质量的2%加酶活力为3700U/g的淀粉酶，于55℃下搅拌酶解6h；f.按照溶液体积0.8%加入ZTC1+1天然澄清剂B组分的1%粘胶液，搅拌1h后按体积0.4%加入ZTC1+1天然澄清剂A组分的1%粘胶液，搅拌1h后，离心，收集上清溶液；g.减压浓缩至原体积的1/4~1/5，加入3倍体积95%乙醇，过夜取沉淀；h.将沉淀溶解后干燥成粉得到虫草多糖。本专利技术在保证得率及纯度的前提下，操作简单，省时省力，只需要一种化学试剂（乙醇），对环境几乎零污染，降低了提取成本，适用于工业化生产。本专利技术所得制品无试剂残留，食用安全，可直接用于动物养殖。具体实施方式本专利技术的一种从蛹虫草固体培养基残基中提取虫草多糖的方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：a.将新鲜蛹虫草固体培养基（小麦）残基干燥，取10公斤粉碎为至少60目；b.按照1:10体积比加水，用匀浆机匀浆后用高压均质机破碎制成浆料；c.按蛹虫草固体培养基残基粉质量的2%加酶活力为1万U/g的纤维素酶，在50℃下搅拌酶解3h，然后按原料质量2%加酶活力为3万U/g的果胶酶，常温酶解6h；此步骤用于细胞壁破壁，使细胞内多糖能充分溶出；d.将酶解液升温至65℃搅拌2h，降至室温离心，收集上清；即利用蛋白质热变性沉淀原理将溶液中大蛋白初步分离；e.按照蛹虫草固体培养基残基粉质量的2%加酶活力为3700U/g的淀粉酶，于55℃下搅拌酶解6h，以除去溶液中淀粉类多糖；f.按照溶液体积0.8%加入ZTC1+1天然澄清剂B组分的1%粘胶液，缓慢搅拌1h后按体积0.4%加入ZTC1+1天然澄清剂A组分的1%粘胶液，缓慢搅拌1h后，离心，收集上清溶液，将溶液中蛋白质的进一步沉淀分离。所述ZTC1+1天然澄清剂购于北京正天成澄清技术有限公司；g.减压浓缩至原体积的1/5，加入3倍体积95%乙醇，过夜取沉淀；h.将沉淀溶解后喷雾干燥或冷冻干燥成粉得到蛹虫草多糖，称重为0.576公斤。用索氏抽提法、凯氏定氮法及硫酸-苯酚法及用分光光度计测定吸光度计算，分别对干燥后的残基及提取物中的粗蛋白、粗脂肪及虫草多糖进行测定，结果如下：结果表明：本专利技术虫草多糖的得率可达5.76%，纯度为63.24%。本专利技术实施例提取物饲喂海参实验：选用起始体重为1.890.15g海参幼体共150只，适应性饲养一周后随机分为空白对照组、酵母多糖组（同类产品对照）、虫草多糖0.5%组、虫草多糖1.0%组和虫草多糖2.0%组，每组30只。饲养于实验室玻璃水槽中，每天换水1/3总体积，用新鲜海水补充。空白对照组饲喂基础饲料，在基础饲料中分别添加1%酵母多糖粉、0.5%虫草多糖粉本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从蛹虫草固体培养基残基中提取虫草多糖的方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：a. 将新鲜蛹虫草固体培养基残基干燥，粉碎为至少60目，得蛹虫草固体培养基残基粉；b. 按照1:10体积比加水，用匀浆机匀浆后用高压均质机破碎制成浆料；c. 按照蛹虫草固体培养基残基粉质量的2%加酶活力为1万U/g的纤维素酶，在50℃下搅拌酶解3h，然后按原料质量2%加酶活力为3万U/g的果胶酶，常温酶解6h；d. 将酶解液升温至65℃搅拌2h，常温离心，收集上清；e. 按照蛹虫草固体培养基残基粉质量的2%加酶活力为3700U/g的淀粉酶，于55℃下搅拌酶解6h；f. 按照溶液体积0.8%加入ZTC 1+1天然澄清剂B组分的1%粘胶液，搅拌1h后按体积0.4%加入ZTC 1+1天然澄清剂A组分的1%粘胶液，搅拌1h后，离心，收集上清溶液；g. 减压浓缩至原体积的1/4~1/5，加入3倍体积95%乙醇，过夜取沉淀；h. 将沉淀溶解后干燥成粉得到虫草多糖。

【技术特征摘要】
1.一种从蛹虫草固体培养基残基中提取虫草多糖的方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：a.将新鲜蛹虫草固体培养基残基干燥，粉碎为至少60目，得蛹虫草固体培养基残基粉；b.按照1:10体积比加水，用匀浆机匀浆后用高压均质机破碎制成浆料；c.按照蛹虫草固体培养基残基粉质量的2%加酶活力为1万U/g的纤维素酶，在50℃下搅拌酶解3h，然后按原料质量2%加酶活力为3万U/g的果胶酶，常温酶解6h；d.将酶解液升温至65...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙永欣，都兴范，温志新，孟楠，李亚洁，李学军，米锐，马淑慧，
申请(专利权)人：辽宁省农业科学院大连生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21