一种人正常阴道上皮3D分化培养物模型的构建方法与用途技术

本发明专利技术属于生物医药领域，公开了一种人正常阴道上皮3D分化培养物模型的构建方法与用途。提供2D生长培养基，获得分离培养自女性阴道癌旁正常组织的正常阴道上皮细胞，未导入任何外源基因，具有正常分化的生理功能。其构建人正常分化阴道上皮3D模型的方法为：2D培养基重悬单细胞，接种到气‑液培养装置中，生长培养基更换为分化培养基培养14‑21天。人阴道上皮3D气‑液培养物分化完全后，接种HSV‑2病毒液，获得HSV‑2病毒感染3D模型。这两种3D模型可用于人正常生殖道上皮的生理学研究和药物毒性安全性评价，HSV‑2病毒感染性疾病、性传播病原体感染性疾病的发病机理研究，以及抗病毒药物的研发。

Construction method and application of human normal vaginal epithelium 3D differentiation culture model

The invention belongs to the field of biological medicine, and discloses a method for constructing a normal vaginal epithelium 3D differentiation culture model of human beings and uses thereof. The 2D growth medium was used to obtain normal vaginal epithelial cells isolated from normal vaginal tissues of female vaginal carcinoma. No foreign gene was introduced into the normal vaginal epithelium, which has normal physiological functions. Methods to construct the normal differentiation of vaginal epithelial 3D model for the 2D medium weight hanging single cells were inoculated into gas liquid culture apparatus, growth medium replacement for the differentiation medium for 14 21 days. People differentiated from the complete culture of vaginal epithelial 3D gas liquid after inoculation with HSV 2 virus liquid, HSV 2 3D model of virus infection. These two kinds of 3D model can be used for normal human reproductive tract epithelial physiology research and safety evaluation of drug toxicity studies, the study of pathogenesis of HSV 2 virus infectious diseases, sexually transmitted pathogens of infectious diseases, and the development of antiviral drugs.

【技术实现步骤摘要】
一种人正常阴道上皮3D分化培养物模型的构建方法与用途
本专利技术属于细胞生物学领域，涉及一种人正常阴道上皮3D分化培养物模型的构建方法及其用途。
技术介绍
人体重要器官都是由器官特异性分化的上皮细胞为其组成成分。这些特异性分化的上皮细胞与不同器官的特异性功能直接相关。生殖道粘膜上最接近于生殖道管腔的是上皮组织层，上皮层暴露于生殖道管腔内的各种病原体中，将生殖道中的病原体与生殖系统分隔开来。因此，生殖道上皮层是机体抵抗外界病原体的第一道天然的物理屏障。而这些重要器官一旦发生病变或退化就会威胁人类的健康，因为这些重要器官是很难被替换的，不同器官的特异性细胞也不能相互取代其它器官的细胞。这些特异性分化的细胞都是很难再生的，更不要说在体外进行培养增殖了。目前对于分离自人和哺乳动物的原代上皮细胞的体外培养仍然是很困难的。应用无血清培养基，有的只能进行短期的原代培养(存活数天，如肺和胰腺等上皮细胞)，有的只能进行有限的传代培养(1-3代，如气管/角膜等上皮细胞)，有的甚至根本不能体外培养(如肝、结肠、前列腺等上皮细胞)，只有来自于人体皮肤的角化上皮细胞可以传代培养10代左右。而且从每个动物或活体组织样品中获得的上皮细胞产量仍然很低，包括细胞的数量、直接分离或短期培养的细胞纯度都是很低的，这些原代和传代上皮细胞的增殖速度也极为有限。为了在体外进行上皮细胞的培养，目前国外尝试通过遗传操作，如转入病毒(SV40T或HPV16E6E7)或细胞癌基因，可以延长体外细胞存活的代数。然而遗传操作的最大缺点是会改变这些细胞的遗传背景和表型，以致让这些正常上皮细胞丢失其正常生理功能，因此这些细胞也不具备正常分化功能。上皮组织层具有一定的极性，主要分为三层细胞：基底层、中层、表层，从而形成了两个不同的表面：顶端面和基底外侧面。顶端面主要面对外环境，而基底面则是接触底层细胞以及全身脉管系统，其形态学及分化程度在研究病原体感染激活的免疫反应中至关重要。性传播病原体如HSV-2病毒在生殖道粘膜上皮的复制以及向神经系统的传播，很大程度上依赖于极性分化的上皮细胞。由于生殖道分层极化上皮组织与其它上皮组织明显不同，对性传播病原体易感性以及药物的毒性反应有显著差异。因此，利用常规二维的细胞培养模型来研究性传播病原体感染机理始终存在着明显的局限性。另一方面，近几十年间的研究大多使用动物模型来研究病毒HSV-2疫苗，由于动物和人类之间的种属差异性，通过动物模型研发的HSV-2疫苗在人身上的效果不明显，因此这些处于动物研究水平的HSV-2疫苗很少能够运用到临床上。同时，利用动物模型并不能更进一步地研究微观的HSV-2感染致病机理。因此，建立一个接近人类生殖道上皮生理状态的研究模型意义重大。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种人正常阴道上皮3D分化培养物模型的构建方法，包括如下步骤：A、人正常阴道上皮细胞原代分离培养：(1)在病人或病人监护人知情同意的情况下，收集阴道癌患者手术切除的癌旁正常组织样品。(2)消化液的配制：含胶原酶和分散酶均为0.2mg/mL的原代上皮细胞生长培养基；其中，原代上皮细胞生长培养基(2D培养基)的配制：DMEM与Ham’sF-12NUTRIENTMIX按体积比3:1混合的培养基，同时添加4-6％胎牛血清、1-3nM三碘甲状腺氨酸(triiodothyronine),0.4-0.65％胰岛素铁硒传递蛋白(insulin-transferrin-selenium)试剂、4-6μg/ml铁传递蛋白(transferrin)、9-11ng/mL表皮生长因子、0.3-0.5μg/mL氢化可的松、35-45μg/mL庆大霉素、45-55nMcalpeptin、35-45ng/ml重组人IL-1RA，及3μg/ml重组人R-Spondin-1。(3)用95～100％(v/v)的乙醇洗分离的组织样品1次，再用PBS(0.01M，pH7.4)洗2次，然后将组织放入含冰上预冷PBS的无菌培养皿中，在解剖显微镜下，用解剖镊子和剪刀去除组织中残留的脂肪。(4)将正常阴道组织样品放入10倍于组织样品体积的含步骤(2)所配制消化液的无菌培养皿中，37℃消化1～3小时。(5)将消化后的组织低速离心(1000rpm)5分钟，去除上清。(6)将细胞沉淀重悬于2-5mL的0.25％(质量体积比)胰酶-EDTA中，置于冰上1小时或室温消化10分钟。(7)然后加入10mL含10％(v/v)FBS的DMEM培养基，低速1000rmp离心5分钟，尽量将上清去除干净。(8)加入2mL温水浴(37℃)的5mg/mL分散酶和200μL的1mg/mLDNaseI，用无菌的P1000一次性塑料枪头反复吹打样品1分钟。(9)加入10mL含10％(v/v)FBS的DMEM，用40～70μm孔径的过滤器过滤细胞悬液，收集过滤后的细胞悬液，低速1000rmp离心5分钟，去除上清。(10)重悬细胞沉淀于2D培养基中，接种于T25或T75的培养瓶培养，培养条件是37℃、5％CO2。B、人正常阴道上皮细胞的传代培养：(1)当在T25或T75的培养瓶中培养的人正常阴道上皮细胞增殖至70～90％丰度时，用1×PBS(0.01M，pH7.4)洗涤细胞三次，再用0.05％(质量体积比)胰酶-EDTA消化单层细胞2～5分钟。(2)加入10mLDMEM中和消化反应1～2分种。(3)1000rmp离心5分钟，弃上清。(4)以1:2，1:3，1:4或1:5比例重悬细胞沉淀于2D培养基，接种于培养瓶培养，培养条件是37℃、5％CO2得到人正常阴道上皮细胞。(5)必要时可将1×106上皮细胞重悬于1-2mL的细胞冻存液(90％胎牛血清和10％DMSO，v/v)中，储存于液氮中备用。C、人正常阴道上皮的气-液3D培养：(1)将0.4μm的MillicellPCFinsert(12mmsize,Millipore)放入六孔板中，每孔最多放三个inserts。(2)用400μl2D培养基重悬5x105个的人阴道上皮细胞，然后接种到每个insert中。(3)每个孔板内部即insert外围加入2ml的2D培养基。(4)将放有insert的六孔板放入湿热培养箱中，37℃，5％CO2培养时长为48小时。(5)将insert内部及外部中的培养基更换为3D分化培养基。3D分化培养基配制为：DMEM与F12按体积比1:1混合的培养基，同时添加0.5-1.2μM胰岛素(Sigma-AldrichI6634)、0.05-0.2μM铁传递蛋白(Sigma-AldrichT0665)，0.05-0.15μM氢化可的松(Sigma-AldrichH0396)，0.005-0.015μM三碘甲状腺氨酸(Sigma-AldrichT6397)，1-4μM肾上腺素(Sigma-AldrichE4642)，0.1-1ng/mL表皮生长因子，2x10–8-8x10–8M视黄酸(Sigma-AldrichR2625)，0.1-1μM磷酸乙醇胺(Sigma-AldrichP0503)，0.1-1μM氨基乙醇(Sigma-AldrichE0135)，1-5μM硫酸锌(Sigma-AldrichZ0251)，100U/mL青霉本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人正常阴道上皮3D分化培养物模型的构建方法，包括如下步骤：A、人正常阴道上皮细胞原代分离培养：（1）在病人或病人监护人知情同意的情况下，收集阴道癌患者手术切除的癌旁正常组织样品；(2) 消化液的配制：含胶原酶和分散酶均为0.2 mg/mL的原代上皮细胞生长培养基；其中，原代上皮细胞生长2D培养基的成分包括：DMEM与Ham’s F‑12 NUTRIENT MIX按体积比3:1混合的培养基，同时添加4‑6％胎牛血清、1‑3nM三碘甲状腺氨酸、0.4‑0.65％胰岛素铁硒传递蛋白、4‑6μg/ml铁传递蛋白、9‑11ng/mL表皮生长因子、0.3‑0.5μg/mL氢化可的松、35‑45μg/mL庆大霉素、45‑55nM calpeptin、35‑45ng/ml重组人IL‑1RA，及3μg/ml重组人R‑Spondin‑1；（3）用95～100%的乙醇洗分离的组织样品1次，再用0.01M，pH 7.4的PBS洗2次，然后将组织放入含冰上预冷PBS的无菌培养皿中，在解剖显微镜下，用解剖镊子和剪刀去除组织中残留的脂肪；（4）将正常阴道组织样品放入10倍于组织样品体积的含步骤（2）所配制消化液的无菌培养皿中，37℃消化1～3小时；（5）将消化后的组织低速离心1000 rpm 5分钟，去除上清；（6）将细胞沉淀重悬于2‑5 mL的0.25%胰酶‑EDTA中，置于冰上1小时或室温消化10分钟；（7）然后加入10 mL含10% FBS的DMEM培养基，低速1000 rmp离心5分钟，尽量将上清去除干净；（8）加入2 mL37℃温水浴的5 mg/mL分散酶和200μL 的1 mg/mL DNase I，用无菌的P1000一次性塑料枪头反复吹打样品1分钟；（9）加入10 mL含10% FBS的DMEM，用40～70 μm孔径的过滤器过滤细胞悬液，收集过滤后的细胞悬液，低速1000 rmp离心 5分钟，去除上清；（10）重悬细胞沉淀于2D培养基中，接种于T25或T75的培养瓶培养，培养条件是37℃、5% CO...

【技术特征摘要】
1.一种人正常阴道上皮3D分化培养物模型的构建方法，包括如下步骤：A、人正常阴道上皮细胞原代分离培养：（1）在病人或病人监护人知情同意的情况下，收集阴道癌患者手术切除的癌旁正常组织样品；(2)消化液的配制：含胶原酶和分散酶均为0.2mg/mL的原代上皮细胞生长培养基；其中，原代上皮细胞生长2D培养基的成分包括：DMEM与Ham’sF-12NUTRIENTMIX按体积比3:1混合的培养基，同时添加4-6％胎牛血清、1-3nM三碘甲状腺氨酸、0.4-0.65％胰岛素铁硒传递蛋白、4-6μg/ml铁传递蛋白、9-11ng/mL表皮生长因子、0.3-0.5μg/mL氢化可的松、35-45μg/mL庆大霉素、45-55nMcalpeptin、35-45ng/ml重组人IL-1RA，及3μg/ml重组人R-Spondin-1；（3）用95～100%的乙醇洗分离的组织样品1次，再用0.01M，pH7.4的PBS洗2次，然后将组织放入含冰上预冷PBS的无菌培养皿中，在解剖显微镜下，用解剖镊子和剪刀去除组织中残留的脂肪；（4）将正常阴道组织样品放入10倍于组织样品体积的含步骤（2）所配制消化液的无菌培养皿中，37℃消化1～3小时；（5）将消化后的组织低速离心1000rpm5分钟，去除上清；（6）将细胞沉淀重悬于2-5mL的0.25%胰酶-EDTA中，置于冰上1小时或室温消化10分钟；（7）然后加入10mL含10%FBS的DMEM培养基，低速1000rmp离心5分钟，尽量将上清去除干净；（8）加入2mL37℃温水浴的5mg/mL分散酶和200μL的1mg/mLDNaseI，用无菌的P1000一次性塑料枪头反复吹打样品1分钟；（9）加入10mL含10%FBS的DMEM，用40～70μm孔径的过滤器过滤细胞悬液，收集过滤后的细胞悬液，低速1000rmp离心5分钟，去除上清；（10）重悬细胞沉淀于2D培养基中，接种于T25或T75的培养瓶培养，培养条件是37℃、5%CO2；B、人正常阴道上皮细胞的传代培养：（1）当在T25或T75的培养瓶中培养的人正常阴道上皮细胞增殖至70～90%丰度时，用1×0.01M，pH7.4PBS洗涤细胞三次，再用0.05%胰酶-EDTA消化单层细胞2～5分钟；（2）加入10mLDMEM中和消化反应1～2分种；（3）1000rmp离心5分钟，弃上清；（4）以1:2，1:3，1:4或1:5比例重悬细胞沉淀于2D培养基，接种于培养瓶培养，培养条件是37℃、5%CO2得到人正常阴道上皮细胞；（5）必要时可将1×106上皮细胞重悬于1-2mL的含90%胎牛血清和10%DMSO的细胞冻存液中，储存于液氮中备用；C、人正常阴道上皮的气-液3D培养：（1）将0.4µm的Millipore公司的12mmMillicellPCFinsert，放入六孔板中，每孔最多放三个inserts；（2）用400µl2D培养基重悬5x105个的人阴道上皮细胞，然后接种到每个insert中；（3）每个孔板内部即insert外围加入2ml的2D培养基；（4）将放有insert的六孔板放入湿热培养箱中，37℃，5%CO2培养时长为48小时；（5）将insert内部及外部中的培养基更换为3D分化培养基；3D分化培养基的配制：DMEM与F12按体积比1:1混合的培养基，同时添加0.5...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晖，叶立娜，朱雅琪，丘建斌，吴小婷，
申请(专利权)人：李晖，
类型：发明
国别省市：湖北,42