一种中华绒螯蟹肝胰腺细胞分离及原代培养方法技术

本发明专利技术涉及一种中华绒螯蟹肝胰腺细胞分离及原代培养方法，包括如下步骤：(1)取中华绒螯蟹胰腺组织用细胞分离液清洗，用剪刀剪碎至1mm

A method for isolation and primary culture of hepatopancreas cells of Eriocheir sinensis

The invention relates to a method for isolation and primary culture of hepatopancreas cells of Chinese Mitten Crab Eriocheir sinensis, which comprises the following steps: (1) taking the Eriocheir sinensis pancreatic tissue and cleaning it with cell separating liquid and cutting it to 1mm with scissors

【技术实现步骤摘要】
一种中华绒螯蟹肝胰腺细胞分离及原代培养方法
本专利技术涉及细胞培养
，具体地说，是一种中华绒螯蟹肝胰腺细胞分离及原代培养方法。
技术介绍
中华绒螯蟹(Eriocheir)属甲壳纲十足目，是我国水产养殖产业的主要养殖品种之一。随着养殖规模扩大，养殖年份增加，各类疾病，尤其是一些病毒病的爆发对中华绒螯蟹养殖产业造成了巨大影响。肝胰腺是蟹类重要的组织器官，肩负着许多生理功能，其中包括合成并分泌消化酶、吸收营养物质、存储无机物，代谢糖类物质，除此之外肝胰腺还参与排泄与蜕皮等生理活动。肝胰腺由多种细胞构成，根据细胞形态和功能可以分为四种，即胚细胞(E细胞)、分泌细胞(B细胞)、吸收细胞(F细胞)、储存细胞(R细胞)。其中R细胞主要形式储存功能，R细胞的胞质中具有圆形的小液泡，近圆形的细胞核靠近细胞基部，部分细胞具有大小不一的双核，两核或紧贴或分开。R细胞中具有大量的粗面内质网和噬碱性强的脂滴，胞质中游离核糖体的数量同样非常之多，除此之外还分布有少量的线粒体和一些小液泡。R细胞发达的脂肪体使其具有储藏功能，储存着河蟹生活必需的能量来源。中国期刊《动物学杂志》2012年2月公开的论文《中华绒螯蟹血细胞原代培养条件的优化》，比较了几种常见血细胞培养基(L-15、2×L-15、3×L-15、M199和RMPI-1640)对中华绒螯蟹血细胞原代培养中细胞形态以及存活率的影响，在筛选获得的最佳培养基中添加不同比例胎牛血清，进一步观察血清对中华绒螯蟹血细胞培养效果的比较。河北大学2009年公开的硕士论文《中华绒螯蟹雄性生殖细胞体外培养的研究》，以中华绒鳌蟹雄性生殖细胞为研究对象，以细胞的贴壁率、存活率和RNA/DNA比值为生理和生化指标，分别测定了几种不同渗透压(600,700,800,900,1000,1100nunol/L)和pH值(6.5,7.0,7.2,7.4,7.6,7.8)条件下体外培养雄性生殖细胞的生长状况，指出1000mmol/L为培养细胞的最适渗透压，在此渗透压条件下,培养细胞的贴壁率、存活率、RNA/DNA最大，培养细胞的适宜pH范围是7.2-7.4，在此pH条件下,细胞的贴壁率、存活率、RNA/DNA均较大。然而现有技术中，关于本专利技术的中华绒螯蟹肝胰腺细胞分离及原代培养方法，目前还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种中华绒螯蟹肝胰腺细胞分离及原代培养方法。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案是：一种中华绒螯蟹肝胰腺细胞分离及原代培养方法，包括如下步骤：(1)取中华绒螯蟹胰腺组织用细胞分离液清洗，用剪刀剪碎至1mm2组织块，取适量组织块至分离液中，用吸管吹打、过滤，滤液离心，得黄色沉淀；(2)取黄色沉淀，加入含100UI/ml青霉素和100μg/ml链霉素的培养基中，吹打均匀后接种至培养板，于CO2细胞培养箱中培养。进一步，所述培养基为GIBCO公司的L-15培养基。进一步，所述L-15培养基制备方法如下：取1L规格L-15干粉溶解于500ml蒸馏水中，在无菌环境下0.22μm滤膜过滤除菌。进一步，所述细胞分离液为D-Hanks液。进一步，所述中华绒螯蟹肝胰腺细胞至72h存活率高于50％。进一步，所述具体方法如下：(1)取中华绒螯蟹胰腺组织用细胞分离液清洗4-5次，用剪刀剪碎至1mm2组织块，再用吸管吸取适量的组织块至装有5ml分离液的离心管中，用吸管吹打50次，200目细胞筛过滤至培养皿中，滤液移至干净离心管中1200r/min离心4min，得黄色沉淀，所述细胞分离液为D-Hanks液；(2)取黄色沉淀，加入含100UI/ml青霉素和100μg/ml链霉素的2×L-15培养基中，吹打均匀后接种至96孔板中,将培养板放置于CO2细胞培养箱中，培养箱保持恒温28℃,5％CO2。本专利技术优点在于：本专利技术通过比较6种甲壳动物细胞培养中常见培养基或缓冲液(2×L-15，3×L-15，M199，DMEM，Crabsaline，D-Hanks)作为细胞分离液对中华绒螯蟹肝胰腺细胞分离的效果，以及4种培养基(2×L-15，3×L-15，M199，DMEM)对中华绒螯蟹肝胰腺细胞贴壁率和存活率的影响，建立了一种中华绒螯蟹肝胰腺细胞分离及原代培养方法，可以稳定培养中华绒螯蟹肝胰腺细胞至72h存活率高于50％，为后续细胞系的建立提供理论依据，为细胞毒理、基因工程等相关领域研究提供细胞工具。本专利技术的方法结合细胞培养技术、活体细胞染色技术、细胞形态学观察技术，对中华绒螯蟹肝胰腺细胞最佳的分离及原代培养条件进行探索。附图说明附图1为四种肝胰腺细胞形态。其中箭头所指分别是B细胞，R细胞，F细胞，E细胞。标尺＝20μm。附图2为6种不同试剂条件下分离中华绒螯蟹肝胰腺细胞存活率。附图3为接种2h后4中培养基下中华绒螯蟹肝胰腺细胞贴壁率。附图4为培养24h不同培养基条件下肝胰腺细胞。a.2×L-15，b.2×L-15，c.DMEM，d.M199；黑色箭头表示肝胰腺细胞，白色箭头表示破裂的细胞。附图5为4种不同培养基条件下肝胰腺细胞培养的存活率情况。不同字母标记表示组间差异性显著(P<0.05)。具体实施方式下面结合具体实施方式，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术记载的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例11材料与方法1.1试验材料中华绒螯蟹采自江苏省金坛市水产技术推广站，规格125g～135g/只，雌雄不限，暂养于75cm×50cm×45cm养殖箱内，光照周期12h：12h,每天换水1/3,早晚固定时间投喂配合饲料，每天吸出缸内残饵和粪便保证水质清晰。Crabsaline(蟹生理盐水)：NaCl(14.5g)，KCl(0.355g)，无水CaCl2(0.899g)，MgSO4·7H2O(1.58g)，NaHCO3(0.25g)，MgCl2·6H2O(0.85g)，HEPES(2.38g)，蒸馏水(500ml)。2×L-15和3×L-15培养基：1L规格L-15干粉(Gibico)分别溶解于500ml，333ml蒸馏水中，在无菌环境下0.22μm滤膜过滤除菌然后分装于无菌蓝盖瓶内。M199及DMEM培养基选用Gibico商用液体培养基。1.2试验方法将6种试剂(2×L-15，3×L-15，M199，DMEM，Crabsaline，D-Hanks)作为细胞分离液，取足量的肝胰腺组织分别用以上分离液清洗4-5次，用剪刀剪碎至1mm2组织块，再用吸管吸取适量的组织至装有5ml分离液的6支离心管中，分别用吸管吹打50次，200目细胞筛过滤至培养皿中，滤液移至干净离心管中1200r/min离心4min。离心后，黄色沉淀部分取出分别分装于预先加入1ml分离液的离心管中，均匀重悬浮。细胞悬液台盼蓝染色，血球计数板计数计算其存活率。根据分离液筛选结果，选取最佳分离液分离中华绒螯蟹肝胰腺细胞，分离过程同上述步骤。离心后得到黄色沉淀，分别取等量加入含双抗(100UI/ml青霉素和100μg/ml链霉素，购自Gibico公司)的2×L-15，3×L-15，DMEM以及本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种中华绒螯蟹肝胰腺细胞分离及原代培养方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取中华绒螯蟹胰腺组织用细胞分离液清洗，用剪刀剪碎至1mm

【技术特征摘要】
1.一种中华绒螯蟹肝胰腺细胞分离及原代培养方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取中华绒螯蟹胰腺组织用细胞分离液清洗，用剪刀剪碎至1mm2组织块，取适量组织块至分离液中，用吸管吹打、过滤，滤液离心，得黄色沉淀；(2)取黄色沉淀，加入含100UI/ml青霉素和100μg/ml链霉素的培养基中，吹打均匀后接种至培养板，于CO2细胞培养箱中培养。2.根据权利要求1所述的中华绒螯蟹肝胰腺细胞分离及原代培养方法，其特征在于，所述培养基为GIBCO公司的L-15培养基。3.根据权利要求2所述的中华绒螯蟹肝胰腺细胞分离及原代培养方法，其特征在于，所述L-15培养基制备方法如下：取1L规格L-15干粉溶解于500ml蒸馏水中，在无菌环境下0.22μm滤膜过滤除菌。4.根据权利要求1所述的中华绒螯蟹肝胰腺细胞分离及原代培养方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪宇航，杨筱珍，成永旭，黄毅，
申请(专利权)人：西昌学院，
类型：发明
国别省市：四川,51