一种人皮肤成纤维细胞培养液及培养方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及一种人皮肤成纤维细胞培养液。本发明专利技术公开了一种人皮肤成纤维细胞培养液，包括：培养基、胎牛血清、HEPES、刺玫果总黄酮提取物、黄芪多糖和胰岛素。所述培养液对对人皮肤成纤维细胞的规模化培养具有良好的效果。

Human skin fibroblast cell culture solution and culture method

The invention relates to the technical field of biology, in particular to a human skin fibroblast culture medium. The invention discloses a human skin fibroblast cell culture medium, which comprises a culture medium, a fetal bovine serum, HEPES, an extract of total flavones of thorn fruit, astragalus polysaccharides and insulin. The culture medium has good effect on large-scale culture of human skin fibroblasts.

【技术实现步骤摘要】
一种人皮肤成纤维细胞培养液及培养方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种人皮肤成纤维细胞培养液及培养方法。
技术介绍
随着人皮肤成纤维细胞分离、培养技术的成熟以及生物医学工程等技术的发展，以培养人皮肤成纤维细胞为基础的生物人工皮肤逐渐发展起来，人们一直希望采用这种体外皮肤支持的方法来代替患者损伤的皮肤功能，为患者等待皮肤移植或自身皮肤再生创造条件。目前认为，生物人工皮肤要达到理想支持效果至少需要1010以上数量级的细胞，而在保障细胞活性的条件下，人皮肤成纤维细胞数量越多，其支持及治疗效果将越佳，因此，人皮肤成纤维细胞体外大规模培养技术已成为生物人工皮肤技术发展的核心技术。虽然人皮肤成纤维细胞体外大规模培养技术己取得了许多重大的进展，目前仍难于满足生物人工皮肤发展的需要，存在着以下问题：1、动物培养环境中抑制因素的积累是提高细胞密度的主要限制因素。1)体外动物细胞培养中氨离子的积累是抑制细胞生长的主要因素之一，对细胞有很大的毒害作用。2)高乳酸浓度抑制细胞生长。2、氧气供应相对不足。氧气是动物细胞生长的必要物质，且人皮肤成纤维细胞更是一种高耗氧量细胞，在人皮肤成纤维细胞大规模培养过程中，消耗大量氧气，可导致溶氧急剧降低。这种氧的缺乏也不仅可直接造成细胞的损害，影响细胞的生长速度，还促进培养基中葡萄糖的无氧酵解，增加乳酸的产生，使得培养基中的PH值急剧下降，又对人皮肤成纤维细胞造成进一步的损害。3、机械损伤。人皮肤成纤维细胞是锚定依赖性细胞，其功能的有效发挥必须依赖于对支架材料等支持物的贴附，而在众多的体外人皮肤成纤维细胞规模培养方法中，微载体悬浮培养技术较其它培养技术具有以下优点：1)表面积/体积比大，单位体积细胞培养基细胞产率高；2)兼有悬浮培养和贴壁培养的优点；3)培养基利用率高；4)放大容易，可以达到几升以上的容积，细胞收获过程不复杂；5)可用简单的显微镜即可观察细胞在微载体表面的生长情况；因而被广泛应用人皮肤成纤维细胞体外规模化高密度三维培养术中。但是，在细胞培养过程中许多作用力(如端流和气泡产生的剪切力、微载体间的碰撞)的作用下，贴在微载体上生长的细胞会受到损伤，抑制细胞生长，并导致细胞死亡。综上所述，大规模细胞培养过程中，维持细胞高的活力是个富有挑战性的课题。最初的研究似乎表明细胞死亡大多由于坏死，而人们逐渐认识到至少是一些细胞系在生物反应器中细胞死亡主要原因是由于氧气、营养物质的缺乏和氨、乳酸等代谢产物蓄积所引起细胞凋亡所致。随着细胞凋亡分子机制研究的不断深入，细胞凋亡的发生被认为是大规模细胞培养过程的重要制约环节，预防并控制细胞凋亡也因此成为研究热点。因此，需要研发一种人皮肤成纤维细胞培养液，其可在同等条件下有效减轻规模化培养中各种培养环境因素对人皮肤成纤维细胞造成的损伤，并抑制人皮肤成纤维细胞凋亡的发生，达到进一步提高人皮肤成纤维细胞规模化培养的密度和功能状态的效果。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种人皮肤成纤维细胞培养液，所述对人皮肤成纤维细胞的规模化培养具有良好的效果。为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：本专利技术公开了一种人皮肤成纤维细胞培养液，包括：培养基、保护剂、胎牛血清和HEPES；所述保护剂包括：刺玫果总黄酮提取物、黄芪多糖和胰岛素。优选的，所述培养液包括以下组分：在本专利技术提供的一实施例中，所述培养液包括以下组分：在本专利技术提供的另一实施例中，所述培养液包括以下组分：在本专利技术提供的另一实施例中，所述培养液包括以下组分：优选地，所述刺玫果总黄酮提取物的制备方法包括以下步骤：a)将刺玫果干燥粉碎，用12～16体积倍量的70～80％乙醇微波提取3次，每次提取的时间为40min、20min和10min，过滤后合并提取液；b)将步骤a得到的提取液上大孔吸附树脂柱，经水洗至无色后，用70～90％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇得浸膏，干燥至恒重。优选地，所述培养基为DMEM。山刺玫(RosadavuricaPall.)为蔷薇科蔷薇属落叶灌木植物,主要分布于我国东北地区,其果实为刺玫果。传统医学将刺玫果列为补药,据《中华大辞典》称:刺玫果具有健脾理气、养血调经之功效。现代医学研究发现,刺玫果具有抗衰老、抗疲劳、耐缺氧,增强人体免疫功能作用,长期服用能显著提高人体中SOD含量。刺玫果为药食同源的宝贵资源，其富含有机酸,黄酮、香豆素、昌醇、三菇、烯烃、皂试、挥发油、多种矿物质、微量元素等多种活性成分,其中的黄酮类化合物具有抗氧化、降低脂质过氧化反应、抗衰老和抗自由基等作用。组分中的黄芪多糖等可有效保护细胞膜和线粒体膜的完整性，从而减少各种培养环境因素对人皮肤成纤维细胞的损伤，能有效保护人皮肤成纤维细胞膜的完整性。氧自由基不仅通过对生物膜中不饱和脂肪酸进行过氧化引起细胞损伤，而且还能通过脂氢过氧化物的分解产物引起细胞损伤，自由基(或氧化应激)在细胞凋亡过程起重要的诱导作用。本专利技术组分中的刺玫果总黄酮提取物是一种天然的水溶性抗氧化剂，它能通过淬灭生物膜内的自由基活性保护人皮肤成纤维细胞膜，使人皮肤成纤维细胞免受氧化损害。此外，刺玫果总黄酮提取物中富含多种水溶性物质，亦能够清除02-，减少H202的产生，还可能阻断羟自由基的产生，可非常有效地减轻活性氧分子对细胞膜及细胞器膜的损伤。Ca2+是细胞凋亡发生过程中重要的信息分子，Ca2+持续升高可使核酸内切酶激活，使DNA片段化，因此钙离子的内稳定失调强与人皮肤成纤维细胞损伤的发生具有非常重要的关系，并被认为是转化至不可逆期的界限步骤。本专利技术中的刺玫果总黄酮提取物具有良好的钙阻滞作用。黄芪多糖不仅可在缺氧条件下经无氧酵解，产生ATP，且不产生有害的代谢产物，还作为一种能量合成促进剂，在缺血、缺氧等应激状态下，激活磷酸果糖激酶和丙酣酸激酶，促进对糖的利用，更快、更多地为人皮肤成纤维细胞提供了能量，使钙泵在缺氧状态下仍能维持一定的生理活性，保持了钙离子内低外高的稳态，从能有效的保护人皮肤成纤维细胞膜的完整性和细胞的功能而减轻人皮肤成纤维细胞损害，抑制了人皮肤成纤维细胞的凋亡。胰岛素可通过作用于人皮肤成纤维细胞表面的胰岛素受体，增强人皮肤成纤维细胞对葡萄糖的摄入和利用，促进人皮肤成纤维细胞蛋白内蛋白合成，从而进一步增强人皮肤成纤维细胞的功能与活力。本专利技术提供了一种人皮肤成纤维细胞培养方法，包括：采用本专利技术提供的人皮肤成纤维细胞培养液培养人皮肤成纤维细胞。作为优选，人皮肤成纤维细胞培养方法采用微载体培养方法。综上所述，本专利技术公开的人皮肤成纤维细胞培养液能通多种机制在人皮肤成纤维细胞规模化培养过程有效地减轻各种因素对人皮肤成纤维细胞的损伤，并抑制人皮肤成纤维细胞凋亡的发生，从而达到进一步提高人皮肤成纤维细胞规模化培养的密度和功能状态，并有效延长人皮肤成纤维细胞的体外生存时间的目的。附图说明图1示实施例1细胞的生长曲线；图2示实施例1负载细胞的微载体在倒置显微镜下观察及DAPI染色后荧光倒置显微镜下观察结果；其中2-1示实验组倒置显微镜观察结果，2-2示实验组DAPI染色结果，2-3示对照组1倒置显微镜观察结果；2-4示对照组1DAPI染色结果；2-5示对照组2倒置显微镜观察结果；2-6示对照组2DAPI染色结果；2-7示对照组3倒置显微镜观察本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人皮肤成纤维细胞培养液，其特征在于，包括：培养基、保护剂、胎牛血清和HEPES；所述保护剂包括：刺玫果总黄酮提取物、黄芪多糖和胰岛素。

【技术特征摘要】
1.一种人皮肤成纤维细胞培养液，其特征在于，包括：培养基、保护剂、胎牛血清和HEPES；所述保护剂包括：刺玫果总黄酮提取物、黄芪多糖和胰岛素。2.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于，包括以下组分：3.根据权利要求1或2所述的培养液，其特征在于，所述刺玫果总黄酮提取物的制备方法包括以下步骤：a)将刺玫果干燥粉碎，用12～16体积倍量的70～80％乙醇微波提取3次，每次提取的时间为40min、20min和10min，过滤后...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈海佳，葛啸虎，王一飞，刘帅，王小燕，
申请(专利权)人：广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44